李吉明 邢清和

(上海市婦幼保健中心，上海 200062)

脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy，SMA)是發(fā)病率居于第二位的嚴重染色體隱性遺傳病，僅次于囊性纖維病，屬于遺傳運動神經(jīng)元病，病理機制主要是通過脊髓前角細胞的變性，導致對稱性近端肌肉無力[1]。

SMA由Guido Werdnig首次報道于1891 年，具有明顯的表型異質(zhì)性，根據(jù)發(fā)病年齡不同，SMA被分為5種亞型[2]，其中O型為嬰兒型，呼吸衰竭是早期關(guān)注點，一般存活不超過6個月。Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型均為兒童型，Ⅰ型為嚴重型，也最常見，占SMA患者45%，多數(shù)由于SMN1基因同源缺失引起，一般患兒在出生后6個月內(nèi)發(fā)病，2歲前因呼吸衰竭死亡。Ⅱ型為中度型，約占患者中20%，Ⅱ型患者6～18個月內(nèi)患病，存活在2年以上；大約30%患者為Ⅲ型，輕度型，18歲內(nèi)患病，預(yù)后良好，可長期存活。Ⅱ、Ⅲ型SMA幾乎是由于SMN1至SMN2的基因轉(zhuǎn)化所致，故輕型SMA患者攜帶有較多的SMN2拷貝[3，4]。Ⅳ型為成人型，發(fā)病年齡多在18歲及以上，約占5% ，發(fā)病緩慢、肢體近端無力逐漸加重、肌肉萎縮，可伴肌束震顫，本型預(yù)后良好，基本不影響壽命。

遺傳流行病學研究顯示，人群中SMA致病突變的攜帶者頻率高達1/54[5]～1/40[6]?；谖覈巳旱拇髽颖玖垦芯匡@示，我國人群中SMA致病突變的攜帶者頻率和世界平均水平近似，介于1/54[7]和1/84[8]之間，以此估算，每10 000～25 000新生兒中就有1人患病。由于遺傳學檢測技術(shù)的快速發(fā)展，各種SMA的檢測方法也快速涌現(xiàn)，基于人群的SMA致病突變篩查已在多個國家開展，本文僅對常用的脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查方法，希望為后續(xù)大規(guī)模做篩查提供借鑒。

1 SMA的遺傳學機制

1995年，Lefebvre等[9]確定運動神經(jīng)元存活基因(SMN)是SMA的致病基因，SMN位于染色體5q11.2-q13.3，編碼全長294個氨基酸、分子量為38kDa的蛋白質(zhì)，物種間高度保守，全身組織普遍表達,在脊髓運動神經(jīng)元中SMN表達豐度最高[10]。SMN基因包含2個高度同源的反向基因：近端粒的SMN1或SMNt(OMIM#600354)和近著絲粒的SMN2或SMNc(OMIM#601627)。SMN1和SMN2序列只有5個核苷酸差異，一個在內(nèi)含子6，一個在外顯子7，內(nèi)含子7中有2個，外顯子8中有1個[11]。7號外顯子840位置的轉(zhuǎn)換(C→T)是一個重要功能突變，該突變是SMN1和SMN2編碼序列唯一的突變，攜帶該突變的SMN2只能產(chǎn)生野生型水平的約10%的完整蛋白，且穩(wěn)定性較差，功能下調(diào)，而SMN1是產(chǎn)生SMN完整功能蛋白的主要基因[12]。SMN1突變可導致SMA表型，突變的主要形式是SMN1部分外顯子缺失或是基因全長缺失，而SMN2拷貝數(shù)數(shù)量則和SMA的嚴重程度有關(guān)[13]。NAIP的拷貝數(shù)與SMA嚴重性也有一定關(guān)聯(lián)，NAIP基因拷貝數(shù)變化可以影響SMA病情嚴重程度[14]。

SMN1基因第7、8 外顯子(E7、E8)是突變熱點，目前認為在超過95%的Ⅰ～Ⅲ型[15]SMA 患者中存在SMN1基因純合缺失，具體表現(xiàn)為SMN1 E7、E8 序列同時缺失，或僅有SMN1 E7序列缺失，只有約5%的患者是由SMN1發(fā)生其他微小突變、雜合缺失或SMN1向SMN2轉(zhuǎn)化導致的SMN1缺失[16，17]。

2 攜帶者類型

SMN1野生型為雙拷貝，但也有人為不同程度的拷貝數(shù)重復，拷貝數(shù)可從重復一次到幾次不等[18]。SMA純合缺失的患者SMN1拷貝數(shù)為0。

SMA攜帶者主要有4種基因型：SMN1 基因在一條染色體上的順式重復和反式缺失的復合體“2+0”型[19]；2條同源染色體上，1條染色體上有1拷貝野生型的SMN1基因，另1條缺失SMN1基因的為“1+0”型；1條染色體上有1拷貝SMN1基因，另1條SMN2基因發(fā)生微小突變的“1+1m”型；1條染色體上有2拷貝SMN1基因，另1條SMN1基因發(fā)生突變的“2+1m”型；“1+0”型攜帶者最常見，約占95%，其他約占5%[20]。因而對SMN1拷貝數(shù)進行檢測，就可以篩查出大部分SMN1拷貝數(shù)為1的攜帶者和拷貝數(shù)為2以上的健康人。因而通過檢測SMN1拷貝數(shù)可篩查區(qū)分健康者和攜帶者。

SMA攜帶者沒有任何臨床表現(xiàn)，如果父親和母親均是攜帶者，則后代有25%的概率獲得2個有缺陷的基因拷貝而顯示SMA表型。

3 脊髓性肌萎縮癥攜帶者常用篩查方法

3.1 多重連接探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA) MLPA是Schouten等于2002年發(fā)明的一項基因診斷新技術(shù)，主要用于基因片段缺失/重復、染色體非整倍體等的檢測，可檢測出基因純合缺失、雜合缺失和拷貝數(shù)增加等基因拷貝數(shù)量的變化[21]。

MLPA檢測包含靶向SMA基因關(guān)鍵區(qū)域的多個探針，特異性探針與SMN1、SMN2基因雜交后進行擴增，根據(jù)擴增產(chǎn)物和參照序列的比值，評價SMN1和SMN2的拷貝數(shù)。無論是SMN1純合或雜合缺失還是向SMN2的轉(zhuǎn)化都可檢測，篩查結(jié)果可靠，已被許多國家管理部門批準用于臨床檢測。MLPA檢測基本步驟如下，經(jīng)過DNA變性、探針雜交、連接和熒光引物 PCR 擴增，進行片段分離和數(shù)據(jù)分析，整個過程耗時24h左右。

丁宇等[22]通過對3名疑似患者和其父母外周血標本，提取基因組DNA，應(yīng)用MLPA試劑盒進行分析，MLPA圖譜可直觀顯示SMN1基因與SMN2基因信號峰值的變化。將每個樣本中每對探針產(chǎn)物峰的相對峰面積，再除以標準對照樣本中相對應(yīng)的產(chǎn)物峰的中位值，即得到比值，也就是該序列的相對拷貝數(shù)，最后校正后得到絕對拷貝數(shù)。結(jié)果不僅診斷出患兒SMN1基因的7號和8號外顯子的拷貝數(shù)皆為0，為純合缺失，同時也檢測出3例患兒父母SMN1基因的7號和8號外顯子的拷貝數(shù)屬于1拷貝范圍，屬于雜合缺失的攜帶者。

羅福薇等[23]使用MLPA方法對15 例患者的父母都檢測出外顯子7 和外顯子8 雜合缺失，同時檢測的44 例無SMA家族史的健康成人，未發(fā)現(xiàn)SMN1基因外顯子7 和8 的缺失，很好地證實了MLPA對SMA攜帶者的篩查作用。

但MLPA對雜質(zhì)污染極其敏感，在制備樣品和操作該技術(shù)時需要非常小心，雖然最低20ng DNA可用于檢測，但是100～200ng DNA模板是臨床檢測推薦的模板量[24]。

3.2 PCR-變性高效液相色譜(PCR-denaturing high performanceliqu id chromatography, PCR-DHPLC) DHPLC是一種新的高通量篩選DNA序列變異的新技術(shù)，這一技術(shù)最先由美國Stanford大學Oefner及Underhill等于1995年報道，其特點是高通量、自動化程度高、靈敏度及特異度均較高，更適合大片段DNA的篩查，檢測快速，價格相對低廉，檢測結(jié)果以圖表顯示，方便判斷[25]。

PCR-DHPLC已經(jīng)成為了SMA篩查的主流方法，龔波等[26]和譚建強等[8]都用此方法做了大規(guī)模攜帶者篩查。主要都是應(yīng)用多重PCR結(jié)合DHPLC進行SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)的檢測，首先通過PCR擴增目標基因，再采用DHPLC半定量方法檢測。 PCR-DHPLC圖形前2個峰是內(nèi)參峰，后2個峰是SMN2、SMN1，待測樣本SMN1、SMN2拷貝數(shù)通過和正常對照結(jié)果的比較計算得出，篩查出SMN1拷貝數(shù)為1的脊髓性肌萎縮癥攜帶者。

3.3 熒光定量PCR 熒光定量PCR又稱qPCR，是一項常見分子生物學實驗技術(shù)。對核酸進行定量分析，應(yīng)用廣泛，用于檢測基因的表達量?？蓪ζ蔚目截悢?shù)變異(copy number variation，CNV)進行分析，對基因進行分型，對DNA要求低，適用于組織、新鮮血液DNA樣本和干血斑DNA樣本[27]。其原理為通過監(jiān)控反應(yīng)體系中熒光強度的變化，記錄檢測熒光達到閾值時的循環(huán)數(shù)(Ct值)。理論上說，起始模板量和Ct值密切相關(guān)，因此我們通過判讀Ct值對樣本進行定量。

任晨春等[28]對臨床確診為SMA的5例患兒及其父母同時用定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)方法檢測，4例患兒SMN1的E7、E8均表現(xiàn)為純合缺失，其父母都表現(xiàn)為SMN1 E7、E8均雜合缺失的攜帶者。1例檢測出SMN1 E7純合缺失，E8雜合缺失的患者，其母親檢測出基因型為SMN1 E7、E8的雜合缺失，父親僅表現(xiàn)為SMN1基因E7的雜合缺失，E8無缺失改變。QF-PCR方法與MLPA法檢測的結(jié)果比對，完全一致。

熒光定量PCR對于SMN1基因的檢測，主要是比較標本中SMN1基因與健康對照的相對量以推定其拷貝數(shù)，所以采用無需標準品的相對定量方法。由于缺失1個SMN1基因模板與野生型之間基因的拷貝數(shù)差異僅為1倍，體現(xiàn)在Ct值上的變化非常小，所以每次檢測標本時一般同時檢測3例健康對照標本，通過公式計算得到目的基因相對參比基因的拷貝數(shù)。這種目的基因相對定量模式，無需制備標準曲線，可靈敏地檢測出基因拷貝數(shù)的差異[29]。

目前國內(nèi)已經(jīng)有幾家公司的熒光定量檢測試劑盒已經(jīng)取得了CFDA的證書，檢測方便，通過熒光定量PCR 擴增就可檢測，通過標準化判讀，總共2～3h內(nèi)完成實驗，得到結(jié)果。

3.4 微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR) 數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)是新型分子診斷技術(shù)，通過有限稀釋將樣本分到許多獨立的區(qū)室，每個區(qū)室最多包含1個拷貝的PCR模板，大多數(shù)區(qū)室并不包含PCR模板分子。PCR反應(yīng)時，多個區(qū)室同時平行獨立擴增。擴增完成，通過熒光信號的有無，計數(shù)陰性和陽性區(qū)室的數(shù)量，可實現(xiàn)絕對定量?，F(xiàn)已在遺傳病分子診斷中使用，可準確檢測0～3拷貝的SMN1基因和0～5拷貝的SMN2基因。dPCR方法非特異性擴增少，檢測SMN1和SMN2基因拷貝數(shù)CV值優(yōu)于TaqMan探針法qPCR技術(shù)檢測的CV值[30]。

Vidal-Folch等[4]用ddPCR方法檢測干血斑樣本，通過特殊設(shè)計的引物和探針，不僅能篩查SMA攜帶者，還能篩查出一定的SMN1“2+0”基因型。

dPCR對DNA要求低，干血斑就能檢測，拷貝數(shù)檢測準確，不易被PCR反應(yīng)抑制劑所干擾。同時檢測成本和其他方法相當。

4 總結(jié)

脊髓性肌萎縮作為常染色體隱性遺傳病，人群攜帶率較高，父母雙方都是攜帶者，生育患兒的概率有25%，50%可能會生育攜帶SMA致病基因的子女。臨床上還沒有行之有效的治療方法，支具或矯形器進行干預(yù)可延緩疾病進展，相關(guān)藥物直到2019年2月底，用于治療5q SMA的反義寡核苷酸藥物諾西那生鈉注射液(Nusinersen，曾用名 IONIS-SMNRX，商品名Spinraza)在我國獲批，雖然上市后國內(nèi)SMA患者無藥可用的局面被打破，但普通患者家庭能否承擔藥物費用仍存疑問，且需反復鞘內(nèi)注射，終身用藥且費用昂貴[31]。

產(chǎn)前篩查利用分子遺傳篩查技術(shù)，可以從源頭降低脊髓性肌萎縮的患兒出生，是一種經(jīng)濟有效的出生缺陷控制方法?？尚械暮Y查方式是對備孕婦女進行攜帶者篩查，如判斷為攜帶者，則對其配偶進行攜帶者篩查，如果夫妻雙方均為攜帶者，則需在妊娠時進行產(chǎn)前診斷，根據(jù)診斷結(jié)果配合遺傳咨詢采取臨床干預(yù)措施，防止受檢者生出SMA患兒。

MLPA分析作為SMA分子診斷的金標準技術(shù)，診斷性高，但是儀器大型，實驗室配置不普遍，且運行易受雜質(zhì)干擾、操作復雜且耗時長。PCR-DHPLC技術(shù)敏感度高，特異性好，成本低廉，是目前大規(guī)模人群樣本篩查常用的技術(shù)。熒光定量PCR檢測技術(shù)，所需熒光定量PCR儀器，實驗室配置比較普遍，實驗數(shù)據(jù)判別方便，同時試劑有CFDA證書。熒光定量PCR技術(shù)成本低、靈敏度高、檢測結(jié)果準確可靠，同時操作簡單，實驗步驟少，無需開蓋檢測等特點，可作為新型大規(guī)模篩查方法。ddPCR屬于絕對定量，擁有高靈敏度、高準確性，實驗過程不易被PCR反應(yīng)抑制劑干擾，對DNA要求低，干血斑就能檢測，作為攜帶者篩查，未來有很大的利用空間。

對于不同樣本類型檢測方面，熒光定量PCR和ddPCR可以使用干燥血斑DNA進行檢查，但是有發(fā)現(xiàn)干燥血斑DNA是單鏈的、高度碎片化的，并且容易被RNA污染，不太可能支持精確測定拷貝數(shù)。所以有條件建議用新鮮血液DNA進行攜帶者篩查，以得到更準確的結(jié)果[32]。

上述的這些篩查技術(shù)還存在一些弊端，會漏檢約5%的特殊突變攜帶者，如“2+0”型、“2+1m”型、“1+1m”基因型。后續(xù)提高篩查準確率，進一步全部篩查出所有攜帶者還是需要解決的問題。

另外如何宣傳和推廣SMA基因篩查也是個社會問題。只有多方努力，加強宣傳力度，提高認知率，同時篩查做到檢出率高，結(jié)果準確，價格合適，大眾才能更好地接受檢測，從而讓SMA攜帶者篩查得到更大的普及，降低SMA的患病率。