許應(yīng)鵬 孫晨 李琦

南京市兒童醫(yī)院耳鼻咽喉科(南京210008)

WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示全球超過5%的人口，約4.66億人有聽力損失，到2050年，將有超過9億人患有聽力損失性疾病，如何改善聽力損失成為亟待解決的問題。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典途徑，通過β-catenin,TCF兩個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，從轉(zhuǎn)錄水平上影響相關(guān)的靶基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育，廣泛的參與各種疾病，包括退行性疾病，代謝性疾病和癌癥的發(fā)生，發(fā)展，與聽覺系統(tǒng)疾病也有著密切的關(guān)系，是解決聽覺疾病的新靶點(diǎn)。本文總結(jié)了Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控聽覺系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展，為聽力疾病的分子生物學(xué)機(jī)制研究與臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路

當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上卷曲蛋白受體（Frizzled receptor，F(xiàn)z）結(jié)合，引起脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LDL-receptor-relatedprotein 5/6，LRP5/6）磷酸化和Fz-LRP5/6復(fù)合物的形成，磷酸化的LRP5/6與Axin蛋白親和，Axin上結(jié)合的糖原合酶激酶 3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3），絡(luò)氨酸激酶1（Casein kinase 1，CK1）磷酸化LRP5/6,進(jìn)一步促進(jìn)LRP5/6與Axin的結(jié)合。通過DEP和PDZ結(jié)構(gòu)域，蓬亂蛋白（Dishevelle，Dvl）與Fz結(jié)合，Dvl和Axin擁有相同的DIX結(jié)構(gòu)域，形成的多聚體能夠促進(jìn)Wnt-Fz-LRP5/6復(fù)合物的形成，β-catenin降解復(fù)合物的解體[2]。另一方面，Wnt與Fz結(jié)合，激活細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的CK1，激活的CK1磷酸化Dvl，釋放GSK3β 結(jié)合蛋白（GSK3β binding protein，GBP），GBP能夠識(shí)別并結(jié)合GSK3β，抑制GSK3β磷酸激酶活性，阻止β-catenin階梯磷酸化。因此，當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí)，Wnt受體復(fù)合物的形成促進(jìn)降解復(fù)合物的解體，導(dǎo)致β-catenin的積聚。

β-catenin在胞質(zhì)中積聚，在多種酶的共同作用被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的β-catenin通過直接結(jié)合一個(gè)低親和力的N端重合位點(diǎn)替代Groucho/TLE等抑制性因子與Tcf/Lef結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。

2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路通調(diào)控聽力疾病機(jī)制

2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控聽力系統(tǒng)發(fā)育

Wnt信號(hào)是胚胎發(fā)育的標(biāo)志，在胚胎發(fā)育的不同階段承擔(dān)著不同的作用，在聽力系統(tǒng)中參與耳的結(jié)構(gòu)特異性發(fā)生，前庭結(jié)構(gòu)的形成和耳蝸的發(fā)育。在胚胎發(fā)育的神經(jīng)發(fā)生期，外胚層在周圍信號(hào)的影響下異化成耳基板，耳基板內(nèi)陷融合形成充滿液體的聽囊，神經(jīng)母細(xì)胞從囊泡中分離到外胚層附近，最終成為前庭和耳蝸（螺旋）顱神經(jīng)節(jié)。同時(shí)，囊泡的單純上皮通過定向生長(zhǎng)，上皮融合和程序性細(xì)胞死亡的局灶性熱點(diǎn)被雕刻成一組腔室和導(dǎo)管[3]。鄰近的間充質(zhì)組織包繞上皮形成封閉的液腔，這些腔室和神經(jīng)節(jié)被軟骨膜包繞保護(hù)，軟骨膜最終骨化形成內(nèi)耳結(jié)構(gòu)[4]。

早期胚胎發(fā)育過程中，Wnt對(duì)前后體軸的形成非常重要，能夠同時(shí)抑制胚胎前化，促進(jìn)胚胎后化。來(lái)自相鄰后腦的高Wnt信號(hào)能夠促進(jìn)耳廓上裂（otic-epibranchial placode，OEP）向耳的分化，低Wnt和高成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）信號(hào)將這種分化限制在OEP的外側(cè)[5]。當(dāng)耳基板內(nèi)陷形成耳蝸囊泡時(shí)，Wnt和Shh信號(hào)通過調(diào)控靶基因Dlx5/6，Hmx2/3和Gbx2在大鼠背腹軸的建立上發(fā)揮著重要作用，,這些基因促進(jìn)了前庭系統(tǒng)內(nèi)淋巴管和半規(guī)管的形成[6]。

Wnt在胚胎耳蝸發(fā)育作用在三個(gè)潛在的窗口期：在小鼠胚胎日（embryonic day，E）12.5Wnt激活促進(jìn)祖細(xì)胞增殖；在E13.5Wnt信號(hào)通路通過調(diào)控Fgf20信號(hào)通路促進(jìn)退出細(xì)胞周期的前感覺細(xì)胞中Sox2的表達(dá)；Wnt信號(hào)通路的激活還促進(jìn)了耳蝸毛細(xì)胞的形成，并且在胚胎發(fā)育和新生早期重新編程支持細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，分化為毛細(xì)胞。

在E12.5，祖細(xì)胞仍在進(jìn)行增殖，通過LiCl激活Wnt通路在體外實(shí)驗(yàn)中能夠極大的擴(kuò)展Sox2的增殖域[4]。成年小鼠海馬區(qū)的研究揭示了Notch結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合sox 2啟動(dòng)子上的rbpj結(jié)合位點(diǎn)，提示Notch可以直接激活sox 2轉(zhuǎn)錄。Wnt能夠在癌細(xì)胞中增強(qiáng)Notch信號(hào)[7]，類似的在早期發(fā)育過程中，Wnt還通過上調(diào)Notch通路中Jagged 1的表達(dá)，在耳基板的形成過程中增強(qiáng)Notch信號(hào)[8]，這些研究表明，Wnt確實(shí)可以提高Notch早期的作用，增強(qiáng)Sox 2的表達(dá)，促進(jìn)祖細(xì)胞增殖，但我們也不排除Wnt可能對(duì)Sox 2的調(diào)控有更直接的影響，這需要等待進(jìn)一步的發(fā)現(xiàn)。

發(fā)育中的耳蝸在E13.5進(jìn)入終末有絲分裂期，Sox2水平的小幅升高能夠觸發(fā)小鼠胚胎干細(xì)胞的分化，但Sox2的過表達(dá)和wnt/β-catenin的強(qiáng)制激活阻止了前感覺細(xì)胞的完全分化。前感覺細(xì)胞向毛細(xì)胞的分化呈現(xiàn)明顯的Sox2濃度依賴性，通過與atoh1增強(qiáng)子區(qū)的結(jié)合，Sox 2直接激活atoh 1，在體外[9]和體內(nèi)[10]誘導(dǎo)異位聽覺毛細(xì)胞的產(chǎn)生。隨后Sox2表達(dá)的減少對(duì)于毛細(xì)胞成熟是必要的，因?yàn)楦咚降腟ox2會(huì)激活A(yù)toh 1的抑制子，維持支持細(xì)胞的命運(yùn)[11]。Sox 2是毛細(xì)胞增殖分化所必需的，高濃度的Sox2又抑制了毛細(xì)胞的分化，因此它與毛細(xì)胞形成的關(guān)系被認(rèn)為是一種“非相干前饋回路”[12]。Wnt可能與Notch一起參與促進(jìn)FGF 20介導(dǎo)的Sox 2濃度在有絲分裂后耳蝸內(nèi)的升高抑制分化。Wnt活化促進(jìn)了早期神經(jīng)前體細(xì)胞基因的表達(dá)，雖然尚不清楚這是通過Sox 2發(fā)生的，還是獨(dú)立發(fā)生的，但有一些初步證據(jù)表明，β-catenin通過與前感覺細(xì)胞中的3’增強(qiáng)子區(qū)域相互作用而上調(diào)了Atoh 1[6]。由此可見，Wnt能夠通過Notch、FGF20等不同途徑，間接或直接的參與到不同階段細(xì)胞命運(yùn)的抉擇。

2.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)聽覺細(xì)胞的保護(hù)作用

2.2.1 Wnt/β-catenin信號(hào)與遺傳性耳聾

聽力損失是人類最常見的神經(jīng)感覺障礙之一，超過50%的聽力損失是遺傳性耳聾造成的，以常染色體隱性遺傳為主的遺傳性耳聾占遺傳性耳聾75%-80%，超過60個(gè)基因與常染色體隱性耳聾相關(guān)[13]。70%的遺傳性耳聾是非綜合征性耳聾（nonsyndromic hearing loss，NSHL），表現(xiàn)為孤立性的聽力損失，不伴隨其他相關(guān)臨床癥狀。

哺乳動(dòng)物內(nèi)耳發(fā)育期間，Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)囊泡發(fā)生，指導(dǎo)前庭器官的形成，在耳蝸毛細(xì)胞發(fā)育中也起著重要作用。低脊椎動(dòng)物的研究顯示，Wnt信號(hào)通路與支持細(xì)胞的增殖、毛細(xì)胞維持和再生有關(guān)，脂蛋白受體相關(guān)蛋白5（LDL-receptor-relatedprotein 5，LRP5）缺乏對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制可能導(dǎo)致聽力損失[14]。通過對(duì)一個(gè)中國(guó)非綜合征感音神經(jīng)性耳聾家系進(jìn)行全外顯子組測(cè)序（whole exome sequencing，WES），尋找在Wnt信號(hào)通路中起重要作用的致病基因LRP5。LRP5基因由22個(gè)內(nèi)含子和23個(gè)外顯子組成，位于11q13染色體上。LRP5蛋白是調(diào)控Wnt信號(hào)通路的膜結(jié)合的Wnt受體，通過四個(gè)重復(fù)的β螺旋/表皮生長(zhǎng)因子（β-propeller/epidermal growth factor，EGF)重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域與Wnt配體結(jié)合[1]。在NSHL家系發(fā)現(xiàn)的LRP5的純合錯(cuò)義突變下調(diào)β-catenin和Lef-1的表達(dá)，抑制下游增殖基因的表達(dá)。LRP5基因敲除直接影響Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致毛細(xì)胞和支持細(xì)胞增殖減少，毛細(xì)胞和支持細(xì)胞數(shù)量減少，最終導(dǎo)致聽力下降[16]。LRP 5突變通過Wnt信號(hào)通路導(dǎo)致聽力損失的發(fā)現(xiàn)能夠幫助科學(xué)家更多地了解耳聾的發(fā)病機(jī)制，并找到更多的預(yù)防和治療耳聾的方法。

2.2.2 Wnt/β-catenin信號(hào)通路與年齡相關(guān)性聾

衰老是一種自然現(xiàn)象，伴隨著生理功能的逐漸退化和疾病的易感性增加。年齡相關(guān)性聽力損失（age-related hearing loss,AHL）是由衰老引起的普遍的感覺神經(jīng)性聽力障礙，以聽聲音和理解語(yǔ)音的能力降低，對(duì)聲音信息的中央處理能力降低以及定位聲源的能力降低為主要癥狀[17]。中心聽覺系統(tǒng)的年齡相關(guān)退化會(huì)影響語(yǔ)音理解和聲源定位，越來(lái)越多的證據(jù)表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，中樞聽覺系統(tǒng)的退化在老年性耳聾的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用[18]。

研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路參與某些衰老相關(guān)疾病，例如β-catenin的表達(dá)減少與年齡相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥有關(guān)[19]，功能失調(diào)的Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)也與阿爾茨海默氏?。ˋlzheimer’s disease，AD）的發(fā)生有關(guān)：降低β-catenin的表達(dá)提高了AD祖細(xì)胞中神經(jīng)損害的發(fā)生，而高表達(dá)的β-catenin能夠通過降低β-淀粉樣蛋白的毒性提供神經(jīng)元保護(hù)[20]。動(dòng)物研究表明，伴隨著Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)降低，D-gal模型鼠和老年大鼠在聽覺皮質(zhì)中表現(xiàn)出更多的神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)變性?？梢奧nt/βcatenin信號(hào)的異常調(diào)控會(huì)使聽覺皮層神經(jīng)元對(duì)凋亡敏感，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)變性。有趣的是，通過長(zhǎng)期的Licl治療誘導(dǎo)的Wnt/b-catenin信號(hào)通路的激活逆轉(zhuǎn)了D-gal誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變，這些可能是通過調(diào)節(jié)B淋巴瘤Mo-MLV插入?yún)^(qū)1（B lymphoma Mo-MLV insertion region 1，BMI1）的表達(dá)而發(fā)生的[21]。典型的Wnt信號(hào)參與了聽覺器官的發(fā)育和聽覺系統(tǒng)功能的維持，這些發(fā)現(xiàn)為Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)老年性聽皮層變性的保護(hù)作用提供了新的證據(jù)，為老年性耳聾的治療提供了潛在的方向。

2.2.3 Wnt/β-catenn信號(hào)通路與藥物性聾

哺乳動(dòng)物的聽覺細(xì)胞有許多線粒體，呈現(xiàn)高耗氧量特點(diǎn)，這使得它們對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，特別是當(dāng)受到噪音或耳毒性藥物的刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，線粒體釋放細(xì)胞色素能夠很快引起細(xì)胞凋亡[22]；一些藥物如順鉑還會(huì)形成水性復(fù)合物聚積導(dǎo)致DNA損傷和交叉結(jié)合，激活caspase3誘導(dǎo)的凋亡；促炎癥因子TNF-α,IL-β，IL-6和NF-kb的釋放也會(huì)導(dǎo)致促凋亡因子的激活[23]。如何減少耳毒性藥物對(duì)聽力的影響是當(dāng)前研究的一個(gè)方向。

Wnt通路的促存活活性在許多組織中報(bào)道，并被認(rèn)為是通過誘導(dǎo)特異性抗凋亡基因介導(dǎo)的。例如，在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中Wnt激活通過增加包括NT3、BDNF和NGF在內(nèi)的保護(hù)性生長(zhǎng)因子的表達(dá)來(lái)減少細(xì)胞凋亡[24]。在耳蝸細(xì)胞中，Wnt通路也發(fā)揮著類似的作用，通過GSK3β抑制劑預(yù)處理的HEI-OC1耳蝸毛細(xì)胞系在經(jīng)過新霉素[25]、順鉑[26]處理過后較對(duì)照組細(xì)胞凋亡明顯減少。研究發(fā)現(xiàn)，新霉素、順鉑等耳毒性藥物造成了HEI-OC1毛細(xì)胞中β-catenin磷酸化的增加，Wnt通路激活后抑制了順鉑誘導(dǎo)的P53的磷酸化，降低了炎性因子NF-kb,TNF-α,IL-6的表達(dá)，積聚的β-catenin有可能直接參與了NF-kb的調(diào)控，但具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究，但毫無(wú)疑問的是激活的Wnt通路能夠保護(hù)毛細(xì)胞，降低藥物的耳毒性。

2.3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控聽覺細(xì)胞再生

感音神經(jīng)性耳聾常由于過度刺激、耳毒性藥物、感染、自身免疫性疾病或老化引起的耳蝸毛細(xì)胞退化引起[27]。非哺乳動(dòng)物斑馬魚和雞中，活躍的Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)受損的耳蝸毛細(xì)胞增殖和再生，而哺乳動(dòng)物中這種損害往往是不可逆的，丟失的聽覺毛細(xì)胞在哺乳動(dòng)物中不能自發(fā)地被替換，再生可能受限于Lgr5（leucine-rich repeat-containing G protein coupled receptor 5）和Axin2陽(yáng)性的祖細(xì)胞[28]，但內(nèi)耳干細(xì)胞、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因工程等技術(shù)的發(fā)展為聽覺細(xì)胞的再生研究提供了條件。

Lgr5是wnt信號(hào)通路的下游靶基因，在多種組織中標(biāo)記成體干細(xì)胞，廣泛存在于胚胎和新生小鼠耳蝸[5]。Lgr5+細(xì)胞具有自我更新，增殖和再生耳蝸毛細(xì)胞的能力，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，均能夠作為耳蝸毛細(xì)胞的祖細(xì)胞。在毛細(xì)胞損傷的情況下，激活Wnt通路，增加Lgr5的表達(dá)，能夠誘導(dǎo)Lgr5+的內(nèi)柱細(xì)胞和第三排Deiters細(xì)胞增殖并分化為新生的耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞，但在未損傷的成人耳蝸中，這種誘導(dǎo)并沒有發(fā)生[2]。與Lgr5類似，Axin2也是wnt通路的下游靶基因，主要在哺乳動(dòng)物耳蝸鼓室邊緣細(xì)胞中表達(dá)[3]。新生兒耳蝸中，位于感覺上皮下方的Axin2+鼓室邊界細(xì)胞在體外具有增殖和再生潛力，在wnt激活劑存在的情況下，這些細(xì)胞迅速進(jìn)入增殖狀態(tài)，分化為毛細(xì)胞和支持細(xì)胞[30]。因此，活化的Wnt信號(hào)影響新生耳蝸中Lgr5+祖細(xì)胞和Axin2+耳蝸鼓室邊緣細(xì)胞的增殖和再生。

Atoh1，一種基本的螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子，在上皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞類型的分化中起著至關(guān)重要的作用，是毛細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Atoh1敲除的小鼠缺乏許多腸道上皮細(xì)胞類型，小腦和脊髓神經(jīng)元發(fā)育不完全，內(nèi)耳毛細(xì)胞完全缺乏[31]。Atoh1對(duì)于在毛細(xì)胞受損母體內(nèi)產(chǎn)生新生毛細(xì)胞是必須且充足的，過表達(dá)的Atoh1誘導(dǎo)非感覺細(xì)胞分化為毛細(xì)胞，新生的內(nèi)毛細(xì)胞形態(tài)正常，能夠發(fā)揮功能，明顯改善母體聽力閾[26]。Wnt通路可以提高Atoh1的表達(dá)，通過與Atoh1的3’增強(qiáng)子內(nèi)的Tcf-Lef位點(diǎn)相互作用，促進(jìn)Atoh1的轉(zhuǎn)錄，Notch信號(hào)調(diào)節(jié)Atoh1表達(dá)的作用也依賴于β-catenin的作用[31]。Atoh1在耳蝸內(nèi)誘導(dǎo)非感覺細(xì)胞分化為新生毛細(xì)胞的能力使得Atoh1恢復(fù)毛細(xì)胞的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在聽力系統(tǒng)發(fā)育的各個(gè)階段發(fā)揮著不可代替的作用，在胚胎發(fā)育階段Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠促進(jìn)聽覺器官的形成、祖細(xì)胞的增殖、毛細(xì)胞的增殖和分化，異常表達(dá)常見于以非綜合征性耳聾為主的常染色體遺傳性耳聾。Wnt/β-catenin信號(hào)通路維持著聽覺系統(tǒng)的正常運(yùn)作，能夠保護(hù)聽覺細(xì)胞，提高聽覺細(xì)胞的抗氧化能力，進(jìn)一步的，Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠通過降低積聚在神經(jīng)細(xì)胞的β-淀粉樣蛋白的毒性來(lái)提供神經(jīng)元保護(hù)。得益于非哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的Wnt/β-catenin通路對(duì)聽覺細(xì)胞干細(xì)胞特性的激活作用，對(duì)于難以逆轉(zhuǎn)的毛細(xì)胞損傷的恢復(fù)也不再是難以觸及。Wnt/β-catenin信號(hào)通路為治療相關(guān)耳聾性疾病提供多個(gè)作用位點(diǎn)，使聽力損失的治療方法有了長(zhǎng)足的發(fā)展并獲得階段性的成果，而如何讓治療走向臨床是我們下一步需要思考的問題。