王財金 弟文靜 馬淑梅 王 洋

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，150080，黑龍江哈爾濱）

大豆灰斑?。–ercospora sojina）于1921年在我國首次發(fā)現(xiàn)后，在國內(nèi)各大豆種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，并且在我國北方春大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生最為嚴重，直接導(dǎo)致大豆品質(zhì)降低，產(chǎn)量損失超過60%[1]。大豆灰斑病病菌為半知菌亞門真菌，具有明顯的生理分化現(xiàn)象，如Pham等[2]用16個鑒別寄主鑒定出11個生理小種；Mian等[3]用10個鑒別寄主鑒定出22個生理小種；丁俊杰等[4]用6個鑒別寄主鑒定出15個生理小種。我國的灰斑病1號生理小種是北方春大豆產(chǎn)區(qū)的第一優(yōu)勢小種[5]，2006-2010年黑龍江省大豆灰斑病生理小種的檢測結(jié)果表明，其在各大豆主產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)頻率最高，為50.5%，平均為40.1%[6]。

選育抗病品種是防治大豆灰斑病的有效方法。利用分子技術(shù)了解不同等位基因的作用，高效利用不同種質(zhì)資源的有益等位基因，在常規(guī)育種或分子育種中有目的地聚合或替代，甚至可以通過分子設(shè)計提高育種效率[7]。以群體連鎖不平衡為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)分析是發(fā)掘攜帶優(yōu)異等位變異和載體材料的定位方法。在大豆抗病性研究中，Sun等[8]利用SSR標(biāo)記通過關(guān)聯(lián)分析鑒定了與大豆疫霉抗性相關(guān)的4個抗性位點；魏崍等[9]利用150份大豆品種與256對SSR標(biāo)記進行關(guān)聯(lián)分析找到差異顯著的關(guān)聯(lián)等位變異位點12個，獲得了對每個小種具有不同抗性的大豆材料；馮莉君[10]利用300份種質(zhì)資源對大豆胞囊線蟲4號生理小種的鑒定發(fā)現(xiàn)了1個新抗源，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了與之相關(guān)聯(lián)的4個連鎖標(biāo)記。

目前，對大豆灰斑病抗性位點發(fā)掘的研究較少，主要有兩種途徑。一種是利用家系作圖群體，張文慧等[11]發(fā)現(xiàn)SSR標(biāo)記Satt565、SOYGPATR和Satt396與灰斑病1號生理小種抗性位點緊密連鎖，董偉等[12]檢測到3個RAPD標(biāo)記與灰斑病1號生理小種抗性位點緊密連鎖；另一種是利用自然群體，董亞楠等[13]發(fā)掘到7個與大豆灰斑病12號生理小種抗性位點相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，分別是Satt052、Satt335、Satt557、Sat_368、Sat_346、Satt243 和Sat_151。

本研究以205份大豆種質(zhì)資源為試驗材料，通過人工接種灰斑病1號生理小種進行抗性鑒定，利用117對SSR標(biāo)記發(fā)掘大豆資源中抗灰斑病1號生理小種的優(yōu)異等位變異和攜帶優(yōu)異等位變異載體材料，為培育抗灰斑病品種提供遺傳信息和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取黑龍江省育成大豆品種96份、外省育成大豆品種34份、地方大豆品種13份和野生大豆資源62份為供試材料（表1）。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆品種灰斑病病情指數(shù)鑒定 用從大豆病粒上分離出的大豆灰斑病1號生理小種配制濃度為1×105孢子/mL的孢子液，在苗期（2片復(fù)葉展開期）利用喉頭噴霧器接種，將菌液噴在2片復(fù)葉上，每盆接種3mL菌液，接種2遍[14]。將保濕罩罩在接種后的幼苗上，保濕48h后將其拿掉，在溫度26℃、相對濕度40%條件下培養(yǎng)2周后調(diào)查發(fā)病情況，2次重復(fù)?；野卟〔∏橹笖?shù)鑒定標(biāo)準(zhǔn)參考馬淑梅[15]的方法。按照大豆灰斑病抗病程度分級標(biāo)準(zhǔn)（表2），計算病情指數(shù)，病情指數(shù)（%）=∑（病級株數(shù)×代表數(shù)值）/株數(shù)總和×發(fā)病最重級代表值×100。

表1 不同來源的205份大豆資源Table 1 A total of 205 soybean resources of different origins

表2 大豆灰斑病鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Cercospera sojina identification grading criteria

1.2.2 DNA提取及SSR引物篩選 利用大豆幼苗期嫩葉，采用改良的CTAB法提取DNA[16]。將DNA濃度稀釋至100ng/μL備用。從大豆基因庫（https：//www.soybase.org）選取117對SSR標(biāo)記（圖1），SSR標(biāo)記由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.3 PCR擴增及電泳 PCR擴增為10μL反應(yīng)體系，含 1.0μL buffer、0.2μL 的 dNTP、1.5μL 的正反SSR引物、0.1μLTaq聚合酶、1.5μL的DNA模板和5.7μL的去離子水。PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，42℃～61℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。反應(yīng)產(chǎn)物于4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中分離，采用銀染法[17]顯色。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu) 利用PowerMarker version 3.25軟件[18]計算117對SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)、基因多樣性和多態(tài)信息含量（PIC）。基于Bayesian模型，利用Structure 2.2軟件[19]對205份大豆資源進行群體結(jié)構(gòu)分析，將亞群數(shù)目（K）設(shè)置為1～9，Markov Chain Monte Carlo（MCMC）開始時的不作數(shù)迭代長度（length of burn-in period）設(shè)為10 000次，再將不作數(shù)迭代后的MCMC設(shè)為100 000次，各獨自運行5次計算Q值。依據(jù)似然值最大原則選取合適K值，如果出現(xiàn)LnP(D)隨群體數(shù)增加而增加，無法確定最適亞群數(shù)情況，則通過計算ΔK來確定K的最優(yōu)亞群數(shù)[20]。

圖1 117對SSR標(biāo)記在大豆染色體上的分布Fig.1 Distribution of 117 SSR markers on the chromosomes of soybean

1.3.2 聚類熱圖 采用NTSYS 2.0軟件計算205份大豆資源的遺傳相似性系數(shù)（genetic similarity，GS），以材料間的遺傳距離（genetic distance，GD）（GD=1-GS）為基礎(chǔ)，運用MeV軟件的層次聚類法（hierarchical clustering）對205份大豆資源群體進行聚類熱圖分析。

1.3.3 關(guān)聯(lián)分析及優(yōu)異等位變異確認 利用Tassel 3.0軟件[21]中一般線性模型（GLM）和混合線性模型（MLM）分別進行性狀-標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。將Q值作為協(xié)變量、SPAGeDi-1.3軟件[22]計算出來的親緣關(guān)系值矩陣作為隨機變量，利用標(biāo)記分別對大豆灰斑病抗性表型值逐一進行回歸分析，選取顯著性P＜0.05和表型變異解釋率R2＞0.05的位點。依據(jù)Bradbury提出的計算公式來確定優(yōu)異等位變異位點，表型效應(yīng)值分析參考文自翔等[23]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰斑病1號生理小種抗性鑒定分析

205份大豆資源對灰斑病1號生理小種的抗性鑒定結(jié)果（表3）表明：高抗資源1份，占供試材料0.49%；抗病資源40份，占供試材料19.51%；中抗資源100份，占供試材料48.78%；感病資源63份，占供試材料30.73%；高感資源1份，占供試材料0.49%。病情指數(shù)變化范圍12%～82%，其中地方品種青扎豆的病情指數(shù)最高（82%），黑龍江育成品種東農(nóng)43的病情指數(shù)最低（12%）。病情指數(shù)總平均值為54.16%，平均變異系數(shù)為20.90%。

表3 不同來源大豆資源抗性鑒定結(jié)果Table 3 Resistance identification results of different origin soybean resources

從表3發(fā)現(xiàn)，病情指數(shù)在4種不同來源的群體中存在差異，地方品種（C）變異系數(shù)最大（24.87%）；外省育成品種（B）變異系數(shù)最?。?.61%）。從4種不同來源群體病情指數(shù)平均值可以看出，黑龍江育成品種（A）和野生資源（D）抗病性相對較好，外省育成品種（B）和地方品種（C）抗病性較弱。

2.2 SSR位點遺傳多樣性分析

117對SSR標(biāo)記均具有多態(tài)性，在全部大豆資源中共檢測出1 420個等位變異，不同位點的等位變異數(shù)變幅為5～19，平均每對SSR標(biāo)記的等位變異數(shù)為 12.14。標(biāo)記 Satt142、Satt449、Satt341、Satt534和Sat_390的等位變異數(shù)最多，為19個；Sat_317、Satt332、Satt291和Sat_087的等位變異數(shù)最少，為5個?；蚨鄻有宰兎?.14～0.88之間，平均為0.74；多態(tài)性信息含量（PIC）變幅在0.13～0.86之間，平均為0.72。

2.3 親緣關(guān)系值分析

利用SPAGeDi-1.3軟件計算兩兩材料間親緣關(guān)系值頻率分布（圖2）。兩兩材料間的親緣關(guān)系值小于0.05的占64.07%，0.05～0.10的占4.29%，0.10～0.15的占7.40%，0.15～0.20的占6.77%，大于0.50的占0.49%，表明205份大豆材料間親緣關(guān)系值普遍偏低，群體間親緣關(guān)系較遠。

2.4 群體結(jié)構(gòu)

利用Structure 2.2軟件對205份大豆材料進行群體結(jié)構(gòu)劃分。LnP(D)值隨著K值的增大而增大（圖3-A），選用ΔK來計算，當(dāng)K=3時，ΔK峰值最明顯（圖3-B）。因此，將材料分為3個亞群（圖3-C），第1亞群（Pop1）有100份材料，包括96份黑龍江省育成品種和4份外省育成品種；第2亞群（Pop2）有43份材料，包括外省育成品種30份和地方品種13份；第3亞群（Pop3）有62份材料，全為野生資源。

2.5 熱圖分析

運用MeV軟件的層次聚類法對205份大豆資源進行聚類熱圖分析（圖4）。結(jié)果顯示，按照遺傳距離的大小，205份大豆資源被明確的分為3個亞群（Pop1、Pop2和Pop3），分析結(jié)果與利用Structure 2.2的群體分析結(jié)果一致。

圖2 205份大豆資源的親緣系值分布圖Fig.2 Distribution of relative kinship value of 205 soybean resources

圖3 205份大豆資源的群體結(jié)構(gòu)Fig.3 Population structure of 205 soybean resources

2.6 關(guān)聯(lián)分析

利用Tassel 3.0軟件中的GLM（Q）和MLM（Q+K）程序進行關(guān)聯(lián)分析（表4）。GLM共檢測到7個與大豆灰斑病1號生理小種抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，分布在6條染色體上，表型變異解釋率范圍在7.58%～16.06%，其中Satt142、Satt431和Satt244對表型變異解釋率超過10.00%；MLM只檢測到1個與大豆灰斑病1號生理小種抗性關(guān)聯(lián)的標(biāo)記Satt332，且與GLM模型檢測的表型變異解釋率一致（9.17%）。

圖4 205份大豆資源聚類熱圖分析結(jié)果Fig.4 Cluster heat map analysis results of 205 soybean resources

表4 與抗性顯著相關(guān)的位點及其表型變異解釋率Table 4 Marker loci associated with resistance and their explained phenotypic variation

2.7 優(yōu)異等位變異及載體材料

通過對大豆灰斑病1號生理小種抗性顯著關(guān)聯(lián)的7個SSR位點進行表型效應(yīng)值分析（表5）。結(jié)果表明，具有增效的效應(yīng)值大于20的等位變異分別為Satt244-230（效應(yīng)值26.16），典型載體材料為12C8646；Satt142-154（效應(yīng)值 21.94），典型載體材料為12C8670；Satt244-186（效應(yīng)值20.19），典型載體材料為12C6175。攜帶上述3個等位變異的材料均為野生資源。全部育成品種中攜帶的增效效應(yīng)值最大的等位變異為Satt142-189（效應(yīng)值8.94），共有8個材料攜帶此等位變異，其中1個為野生資源，其余7個均為黑龍江省育成品種，分別為東農(nóng)43、東農(nóng)47、合豐45、黑河20、黑河26、黑河43和綏農(nóng)25。

表5 與抗性顯著關(guān)聯(lián)的位點其增效等位變異對應(yīng)的表型效應(yīng)Table 5 Phenotypic effect of some positive alleles at loci significantly associated with resistance

3 討論

大豆灰斑病在北方大豆主產(chǎn)區(qū)常有發(fā)生，灰斑病1號生理小種是黑龍江省產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢生理小種，對大豆產(chǎn)量和品質(zhì)危害較大。在生產(chǎn)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，灰斑病的發(fā)生與品種關(guān)系密切，在發(fā)病較重的地區(qū)推廣種植抗灰斑病的品種較少，大部分為中感至感病品種，甚至還有一些高感品種。因此，培育和推廣抗灰斑病大豆品種是減少病害損失的有效途徑之一。

我國在20世紀80年代開始抗灰斑病大豆品種的選育工作，利用常規(guī)育種方法培育了一批具有抗性的品種。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，對重要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記的發(fā)掘為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了遺傳信息，但對灰斑病抗性基因的相關(guān)發(fā)掘研究不多，對灰斑病1號生理小種抗性遺傳分析只有張文慧等[11]利用家系作圖群體進行過報道，并在4號染色體上找到了3個與抗性基因連鎖的標(biāo)記，連鎖順序和連鎖距離為Satt565-6.2cM-SOYGPATR-6.5cM-Hrcs1-14.7cM-Satt396。

本研究以黑龍江省育成品種、地方品種和野生資源構(gòu)建關(guān)聯(lián)群體，進行了灰斑病1號生理小種抗性的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)大豆資源對灰斑病1號生理小種抗性具有較為廣泛的遺傳變異；檢測到7個與抗性位點關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記，其中位于12號染色體上的Satt142對表型變異的解釋率最大（16.06%）；在本研究中檢測到與抗性位點關(guān)聯(lián)的Satt244，其與品種Davis攜帶的抗多個生理小種的Rcs3基因[24]相關(guān)聯(lián)。在發(fā)掘到的36個優(yōu)異等位變異中增效效應(yīng)值大于20的等位變異有3個，都存在于野生資源中。育成品種中增效效應(yīng)值最大為8.94，分布在7個黑龍江育成品種中，其中東農(nóng)43檢測到7個具有增效效應(yīng)的等位變異，表型效應(yīng)變幅在0.32～8.94。在地方品種中分布的增效效應(yīng)值均較小。由此推測，野生資源通過長期自然選擇，群體中保留了抗灰斑病的基因；而地方材料沒有進行過更多的選擇，群體的抗病性較弱。

目前，關(guān)于灰斑病1號生理小種抗性的遺傳分析報道較少，本研究發(fā)掘到的抗灰斑病1號生理小種7個SSR標(biāo)記位點及具有增效表型值的等位變異和載體材料可為培育抗灰斑病1號小種品種提供遺傳信息。

4 結(jié)論

檢測到與灰斑病1號生理小種抗性顯著關(guān)聯(lián)的SSR位點7個，分別為Satt142、Satt431、Satt244、Satt332、Satt233、Satt387和 Satt309，其中Satt142對表型變異的解釋率最大，為16.06%。對灰斑病1號生理小種抗性具有增效作用的等位變異有36個，野生資源中效應(yīng)值較大的3個等位變異分別為Satt244-230、Satt142-154和Satt244-186，3個典型材料分別為12C8646、12C8670和12C6175；育成品種中具有最大增效值的等位變異為Satt142-189（8.94），典型載體材料為東農(nóng)43。