趙宇楊 宋 健 邱麗娟

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物種質(zhì)資源與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，100081，北京；2長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，434025，湖北荊州）

蛋白質(zhì)組學(xué)的概念最早由Wilkins和Williams于1994年提出，蛋白質(zhì)組是基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)的總和[1]。根據(jù)研究內(nèi)容，蛋白質(zhì)組學(xué)可分為兩類，一類是“差異”蛋白質(zhì)組學(xué)，用于鑒定和篩選不同樣本不同條件下的蛋白質(zhì)組的區(qū)別，旨在尋找引起差異的關(guān)鍵蛋白；另一類是“完全”蛋白質(zhì)組學(xué)，是對某一物種中一種組織或器官內(nèi)全部蛋白質(zhì)的研究[2]。凝膠電泳和質(zhì)譜鑒定是蛋白質(zhì)組研究的兩大技術(shù)手段。凝膠電泳是分離蛋白質(zhì)的重要技術(shù)，包括SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和雙向凝膠電泳，電泳后將所需要的蛋白條帶或蛋白點(diǎn)切割下來進(jìn)行膠內(nèi)酶解，然后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[3]。質(zhì)譜技術(shù)的不斷更新和植物基因組測序的逐步完善推動了植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展。

關(guān)于大豆蛋白質(zhì)組的首次報道是利用2-DE法分離大豆種子油體相關(guān)蛋白[4]，隨后從2002年開始逐漸興起[5]，廣泛應(yīng)用于大豆根[6]、莖[7]、葉片[8]、種子[9]等組織器官。其中大豆葉片蛋白質(zhì)組參考圖譜是Xu等[8]首次構(gòu)建的，他們利用2-DE、MALDI-TOF MS和LC-MS/MS技術(shù)對栽培大豆Clark葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，鑒定出260個蛋白點(diǎn)。Ahsan等[10]利用2-DE和MALDI-TOF MS技術(shù)對栽培大豆Enrei葉片不同發(fā)育時期真葉、第1個三出復(fù)葉和成熟葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究，鑒定出超過500種蛋白。鄭維薇[11]利用2-DE、MALDITOF MS技術(shù)對大豆地方品種、野生品種和育成品種的幼嫩葉片進(jìn)行分析和比較，鑒定出727種蛋白。大豆葉片蛋白質(zhì)組在鹽[12]、干旱[13]、臭氧[14]和激素[15]等非生物脅迫和不同處理中的相關(guān)研究較多，Tian等[16]對耐寒和低溫敏感春大豆品種的幼苗葉片在5℃條件下處理12h和24h的蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較分析，共鑒定到1 320種蛋白，其中有57種差異蛋白，參與13個代謝途徑和細(xì)胞過程。Gupta等[15]利用HPLC和LC-MS/MS技術(shù)對脫落酸（ABA）和乙烯（ET）處理后的大豆葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，鑒定到4 192種蛋白。隨著研究水平的不斷提高，大豆蛋白質(zhì)組學(xué)已從組織轉(zhuǎn)向亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Arai等[17]利用2-DE和MALDI-TOF MS技術(shù)對黃化大豆子葉過氧化物酶體進(jìn)行分析，共鑒定到173種蛋白。Kamal等[18]利用無凝膠和MS/MS技術(shù)分析大豆根部線粒體蛋白質(zhì)組，鑒定到98種蛋白。然而，有關(guān)大豆葉片類囊體蛋白的研究尚鮮見報道。

光合作用的光反應(yīng)發(fā)生在葉綠體的類囊體膜上，類囊體膜上主要包括光合系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）、光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）、細(xì)胞色素b6f和ATP復(fù)合酶4種蛋白復(fù)合物。這些膜蛋白的組成和穩(wěn)定性對類囊體膜的結(jié)構(gòu)和功能起著至關(guān)重要的作用，如基粒的數(shù)目、基粒的堆疊程度和光合作用效率等[19-20]。研究這些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，對于了解類囊體膜光合作用效率和穩(wěn)定性的分子機(jī)制及提高農(nóng)作物的光合產(chǎn)量來達(dá)到高產(chǎn)具有重要意義。

本文以近等基因系NIL-G（綠色種皮）和NIL-Y（黃色種皮）為材料，采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，系統(tǒng)研究葉片類囊體蛋白復(fù)合物，從蛋白質(zhì)組水平了解1對近等基因系葉片的類囊體蛋白之間的差異，為大豆葉片類囊體蛋白的研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

前期利用黃色種皮大豆品系ZP95-5383為母本、深褐色種皮野生大豆NY279為父本，于2008年在北京順義配制雜交組合，2009年在海南種植F1，2010年在北京順義種植F2，利用F2群體進(jìn)行定位分析。2010年在海南加代繁殖F3，2011-2013年分別在海南和北京順義以單粒傳方式衍生出重組自交系（RIL）群體。利用開發(fā)的dCAPS標(biāo)記850-dCAPs-MseI檢測GmSG基因型，同時利用42對SSR標(biāo)記鑒定遺傳背景，從殘余雜合系中選擇出NIL-G和NIL-Y，二者遺傳背景相似性為97.6%，NIL-G攜帶GmSG基因型，表現(xiàn)為綠色種皮，NIL-Y攜帶Gmsg基因型，表現(xiàn)為黃色種皮[21]。Wang等[22]利用GWAS關(guān)聯(lián)到1個與種皮顏色相關(guān)的SNP，與G位點(diǎn)是同一個基因，并證明其與種子休眠有關(guān)。這對G位點(diǎn)近等基因系用于本試驗(yàn)。將其種植于培養(yǎng)箱中，光周期16h（光）/8h（暗），溫度為28℃（日）/26℃（夜），生長至第3個三出復(fù)葉完全展開后用于類囊體蛋白試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 大豆葉片類囊體膜蛋白檢測 大豆葉片類囊體膜蛋白樣品的制備：參照Zhou等[23]的方法提取葉片類囊體膜蛋白，稍有調(diào)整。分別取1g葉片，加入約5mL預(yù)冷的提取緩沖液（0.4mol/L蔗糖，0.01mol/L NaCl，0.002mol/L MgCl2·6H2O，0.05mol/L Hepes，pH=7.8），在冰浴條件下研磨至勻漿，用4層擦鏡紙過濾，5 000g 4℃離心10min，類囊體膜用洗滌緩沖液（0.33mol/L Sorbitol，0.05mol/L Bis-Tris，pH=7.0）洗滌數(shù)次至無雜質(zhì)，然后用適量的懸浮緩沖液（0.025mol/L Bis-Tris，20%甘油，pH=7.0）懸浮沉淀，樣品于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE電泳：采用Bio-Rad小型垂直凝膠電泳，濃縮膠濃度5%，電壓80V，分離膠濃度12%，電壓120V，凝膠厚度為1.5mm。當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)跑到凝膠底部時停止電泳。將完整的凝膠從玻璃板上剝離，放入染色液考馬斯亮藍(lán)R-250（冰醋酸60mL，乙醇440mL及考馬斯亮藍(lán)R-250 2.25g用超純水定容至1L）染色1h，取出放入脫色液（冰醋酸50mL和甲醇200mL，用超純水定容至1L）中直至凝膠背景變透明。

1.2.2 蛋白酶切 首先用滅菌的手術(shù)刀將膠切成1mm的小塊，置于1.5mL Eppendorf離心管中；用200μL的雙蒸水洗滌2次，每次10min；加入考染脫色液[50mmol/L NH4HCO3與ACN(1∶1)]脫色15min，再用雙蒸水洗，重復(fù)3次，直至膠塊完全脫色；加入100μL ACN進(jìn)行脫水直至膠粒變白，真空抽干 10min；加入 200μL 10mmol/L DTT（25mmol/L NH4HCO3溶解），37℃水浴 1h，加入 100μL ACN進(jìn)行脫水直至膠粒變白；加入200μL 55mmol/L 生長素（IAA）（25mmol/L NH4HCO3溶解），黑暗處理30min，加入100μL ACN脫水直至膠粒變白；膠粒分別用ddH2O、ACN、ddH2O、ACN進(jìn)行混懸清洗 ，每 次 10min；將 100μL 的 0.01μg/μL 胰 蛋 白酶工作液（酶液用25mmol/L NH4HCO3稀釋）加入膠塊中，讓膠粒與酶液充分接觸，于4℃放置30min至膠粒把酶液完全吸收后，再加入100μL的25mmol/L NH4HCO3，37℃過夜；第2天離心收集酶解上清液，置于一新離心管中；剩余膠粒用抽提緩沖液（5% TFA、95% ddH2O）1h，收集酶解上清液，置上一離心管中合并；剩余膠粒再用緩沖液（2.5%TFA、50% ACN、47.5% ddH2O）抽提1h，收集酶解上清液，置于上一離心管中合并；真空凍干，–20℃保存。

1.2.3 蛋白質(zhì)譜與數(shù)據(jù)檢索 質(zhì)譜鑒定由北京青蓮百奧生物科技有限公司完成。利用Thermo Q-Exactive型質(zhì)譜儀完成Label-free的質(zhì)譜分析，采用MaxQuant軟件處理質(zhì)譜原始文件。參數(shù)設(shè)置：固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化（Carbamidomethyl），可變修飾為甲硫氨酸（M）氧化的自發(fā)脫氨基，母離子搜索誤差±15mg/L，碎片離子質(zhì)量偏差±0.5Da，最多允許2個胰蛋白酶漏切位點(diǎn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 按照細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過程，利用在線分析工具DAVID比較分析已鑒定的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。利用在線網(wǎng)站KEGG分析蛋白通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆葉片類囊體蛋白電泳分析

提取葉片類囊體蛋白，經(jīng)SDS-PAGE梯度凝膠電泳檢測，結(jié)果（圖1）顯示近等基因系NIL-G和NIL-Y之間的平行度較好，主條帶較清晰，表明蛋白提取效果理想，樣品純度可用于下一步質(zhì)譜鑒定。為了盡可能鑒定到更多的蛋白，對凝膠條帶按照分子量大小分3段（小于25、25～45和大于45kDa）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

圖1 近等基因系葉片類囊體蛋白SDS-PAGE檢測Fig.1 Detection of thylakoid proteins in leaves of near-isogenic lines by SDS-PAGE

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

為了提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，降低假陽性率，選取報告置信度在95%以上的蛋白并且排除分子量不在選定區(qū)域的蛋白，如表1所示，經(jīng)鑒定，NIL-G中共檢測到2 170種蛋白，其中分子量小于25kDa的有485種，25～45kDa的有656種，大于45kDa的有1 029種；NIL-Y中共檢測到1 730種蛋白，其中分子量小于25kDa的有373種，25～45kDa的有458種，大于45kDa的有899種。NIL-G葉片類囊體中特異性表達(dá)的蛋白1 140種，NIL-Y葉片類囊體中特異性表達(dá)的蛋白700種。共檢測到相同蛋白1 030種，其中表達(dá)存在差異且差異大于3倍的蛋白有68種，NIL-G葉片類囊體中含量高的有23種，NIL-Y葉片類囊體中含量高的有45種。

表1 分段質(zhì)譜鑒定近等基因系NIL-G和NIL-Y大豆葉片類囊體蛋白數(shù)目Table 1 Identification of thylakoid proteins number in soybean leaves of near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y by segmented mass spectrometry

2.3 大豆近等基因系葉片類囊體特異蛋白GO注釋分析

利用DAVID軟件分別對近等基因系大豆葉片類囊體特異蛋白進(jìn)行GO注釋分析，主要分為生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3類。NIL-G葉片類囊體蛋白參與生物學(xué)過程的占55.2%，構(gòu)成細(xì)胞組分的占60.5%，參與分子功能的占68.8%；而NIL-Y葉片類囊體蛋白參與生物學(xué)過程的占55.6%，構(gòu)成細(xì)胞組分的占61.2%，參與分子功能的占63.5%。

如圖2所示，NIL-G和NIL-Y葉片類囊體特異蛋白均參與大量的翻譯、蛋白折疊、信號傳導(dǎo)等途徑，同時它們都在光合作用過程中發(fā)揮功能，但NIL-G葉片類囊體蛋白中特異的是與PSⅠ捕光色素、電子傳遞及葉綠素生物合成相關(guān)的蛋白，NIL-Y葉片類囊體中特異的是與PSⅡ穩(wěn)定性相關(guān)的蛋白。在兩者共有的生物學(xué)途徑中NIL-G鑒定到的蛋白數(shù)目均高于NIL-Y。

膜組分、大分子復(fù)合物及各系統(tǒng)亞基所占比例最大，說明2種材料中膜組分仍是不可或缺的重要組成成分，它們同時參與PSⅠ和PSⅡ的組成，NIL-G葉片類囊體蛋白中特異蛋白的特異細(xì)胞組分為PSⅠ反應(yīng)中心，而NIL-Y葉片類囊體蛋白中葉綠體基質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是其特異組分（圖3）。

NIL-G和NIL-Y葉片類囊體特異蛋白中參與核糖體結(jié)構(gòu)組成功能占比最大，核糖體負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄翻譯，這一結(jié)果與生物學(xué)過程中參與翻譯途徑為主相吻合。同時特異蛋白的分子功能還集中體現(xiàn)在結(jié)合GTP、NAD蛋白及葉綠素。其中NIL-G葉片類囊體特異蛋白中特有電子載體活性、結(jié)合鐵離子等分子功能，NIL-Y葉片類囊體蛋白中特有結(jié)合色素和FMN的分子功能（圖4）。

圖2 近等基因系NIL-G和NIL-Y特異蛋白的生物學(xué)途徑水平GO注釋Fig.2 GO annotation of specific proteins of near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y at biological pathway level

圖3 近等基因系NIL-G和NIL-Y特異蛋白的細(xì)胞組分水平GO注釋Fig.3 GO annotation of specific proteins of near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y at cellular component level

圖4 近等基因系NIL-G和NIL-Y特異蛋白的分子功能水平GO注釋Fig.4 GO annotation of specific proteins of near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y at molecular functional level

2.4 大豆近等基因系葉片類囊體特異蛋白KEGG通路分析

NIL-G葉片類囊體總蛋白中有583種蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，特異蛋白中有407種蛋白有功能注釋，共參與19條代謝通路。參與代謝途徑的蛋白最多，共132種，其余蛋白主要參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝和氨基酸生物合成等，涉及光合作用和卟啉與葉綠素代謝的蛋白有29種（圖5），可以看出，處于同一時期的大豆葉片，NIL-G葉片類囊體中參與光合作用和葉綠素代謝途徑的蛋白更多。

為了進(jìn)一步確定總蛋白和特異蛋白參與的通路，在GO注釋的基礎(chǔ)上，利用KEGG對總蛋白和特異蛋白參與的通路進(jìn)行分析。結(jié)果表明，NIL-Y葉片類囊體總蛋白中有496種蛋白在KEGG數(shù)據(jù)庫中有功能注釋，特異蛋白中有276種蛋白有功能注釋。從圖6可以看出，276種特異蛋白共參與18條代謝通路，參與代謝途徑的蛋白最多，有85種，其余分別參與次生代謝產(chǎn)物生物合成、碳代謝和氨基酸生物合成等，參與光合作用和卟啉與葉綠素代謝途徑的蛋白較少，共12種。

圖6 近等基因系NIL-Y中特異蛋白的KEGG通路分析Fig.6 Analysis of KEGG pathway of specific proteins in near-isogenic line NIL-Y

從表2可以看出，NIL-G葉片類囊體特異蛋白中涉及光合作用和天線蛋白的共有20種，其中未定義蛋白5種，其余15種蛋白分別參與PSⅠ的PsaD，反應(yīng)中心亞基Ⅱ和Ⅲ；PSⅡ的PsbP和PsbO；光合電子傳遞鏈的FNR和Fd；ATPase的gamma鏈；葉綠素a/b結(jié)合蛋白CP24、CP29和P4，LHCII型葉綠素a/b結(jié)合蛋白，PSⅡ型葉綠素a/b結(jié)合蛋白。NIL-Y葉片類囊體特異蛋白參與光合作用和天線蛋白的共7種，其中未定義蛋白2種，其余5種蛋白分別為PSⅡ的PsbR和Psb27、ATPase的b鏈、葉綠素a/b結(jié)合蛋白6A和CP26。NIL-Y葉片類囊體中的特異蛋白主要與PSⅡ和ATPase相關(guān)；而NIL-G葉片類囊體中的特異蛋白不僅參與PSⅡ和ATPase，還與PSⅠ和光合電子傳遞鏈密切相關(guān)。

表2 近等基因系NIL-G和NIL-Y特異蛋白中與光合作用和天線蛋白相關(guān)蛋白Table 2 Specific proteins related to photosynthesis and antenna in near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y

2.5 大豆近等基因系葉片類囊體表達(dá)存在差異的蛋白質(zhì)分析

在NIL-G和NIL-Y葉片類囊體中共有蛋白為1 030種，其中表達(dá)存在差異的蛋白（差異＞3倍）共68種，包括NIL-Y葉片類囊體中上調(diào)的蛋白質(zhì)45種，其中有功能注釋的22種；在NIL-G葉片類囊體中上調(diào)的蛋白質(zhì)23種，有功能注釋的17種。將有功能注釋的39種蛋白進(jìn)行層次聚類分析（圖7）。這些表達(dá)存在差異的蛋白分為兩類，第一類以碳代謝及核糖體途徑為主，共26種，其中NIL-Y葉片類囊體蛋白占65.4%；第二類主要為光合作用途徑，共計13種，NIL-G葉片類囊體蛋白占61.5%。光合作用途徑的差異蛋白主要為葉綠素a/b結(jié)合蛋白，它們作為光受體在捕獲和傳遞光能過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

3.1 不同物種近等基因系在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用

近等基因系是1988年由Young等[24]和Muehlbauer等[25]提出，可通過多代回交、重組自交和分離突變體等途徑獲得。由于近等基因系僅在目標(biāo)性狀基因存在差異且遺傳背景相同，因此是分子水平上遺傳研究的理想材料。近等基因系材料廣泛應(yīng)用于基因定位，近年來在小麥[26]、水稻[27]和玉米[28]等作物的籽粒[26]、根[27]和葉[28]等差異蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用也不斷加強(qiáng)，篩選出了大量的差異蛋白。例如Lesage等[26]對面包小麥胚乳硬度近等基因系籽粒發(fā)育4個階段蛋白質(zhì)組分析，鑒定出87種差異表達(dá)蛋白，其中54種蛋白是功能已知的蛋白。Torabi等[27]以水稻親本Nipponbare與其攜帶主要磷攝取QTL（Pup1）的近等基因系為材料，比較了1μmol/L和100μmol/L磷脅迫下根系蛋白質(zhì)組的變化，在2-DE凝膠上重復(fù)檢測出669種蛋白，有32種蛋白在2種基因型上有顯著變化，其中低磷條件下存在17種差異蛋白。Wang等[28]利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)在玉米自交系沈137及其近等基因系第5、10、19片新展開葉主脈中鑒定到24種差異蛋白，其中第10葉期沈137及其近等基因系中存在19個差異蛋白。與其他作物相比，大豆近等基因系的差異蛋白組研究報道極少，僅在大豆閉鎖花[29]和蚜蟲[30]方面有所應(yīng)用。Khan等[29]以大豆閉鎖花近等基因系為材料，對花芽進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，鑒定出640種蛋白質(zhì)，其中表達(dá)差異蛋白19種。本研究首次利用比較蛋白質(zhì)組分析G位點(diǎn)近等基因系對幼嫩葉片進(jìn)行鑒定，不僅分別鑒定出NIL-G和NIL-Y特有蛋白1 140種和700種，還鑒定出表達(dá)量存在差異的蛋白68種，為闡明大豆葉片類囊體蛋白質(zhì)組解析提供了重要參考。

圖7 近等基因系NIL-G和NIL-Y表達(dá)存在差異的蛋白質(zhì)層次聚類分析Fig.7 Hierarchical clustering analysis of proteins with different expression of near-isogenic lines NIL-G and NIL-Y

3.2 植物類囊體蛋白的研究進(jìn)展

類囊體是光合作用和電子傳遞離不開的載體，是葉綠體的核心組分。高等植物葉綠體中的類囊體膜主要包含4種高豐度的多亞基膜蛋白，分別為PSⅠ、PSⅡ、細(xì)胞色素b6f復(fù)合物（Cytb6f）和ATP合酶（ATPase）。電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合促進(jìn)了植物類囊體蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展[31-34]。Kashino等[31]對藍(lán)藻類囊體PSⅡ中鑒定到的31個蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了5種新的功能未知蛋白。Steven等[32]利用LC-MS/MS技術(shù)鑒定出525種擬南芥類囊體蛋白，這些蛋白在光合作用能量傳遞和轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用。Peltier等[33]對豌豆類囊體蛋白進(jìn)行分析，鑒定到200～230種可溶和外周蛋白。Shao等[34]利用BN/SDS-PAGE雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜的方法對水稻葉片類囊體進(jìn)行分析，共鑒定出58個蛋白點(diǎn)。本研究采用一維凝膠電泳的方法，有效避免了雙向電泳試驗(yàn)過程復(fù)雜、操作步驟多、重復(fù)性差和疏水性膜蛋白檢測效率低的問題[35-37]。同時，本研究利用分級質(zhì)譜在NIL-Y葉片類囊體中鑒定出多達(dá)1 730種蛋白，其中在KEGG中有功能注釋的496種，未知功能蛋白1 234種；在NIL-G葉片類囊體中鑒定到2 170種蛋白，有功能注釋的583種，未知功能蛋白1 587種。與前人相比，鑒定到類囊體蛋白數(shù)目最多，且利用近等基因系研究植物類囊體尚未見報道，為大豆類囊體蛋白的研究提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用質(zhì)譜技術(shù)鑒定1對近等基因系大豆葉片類囊體蛋白，NIL-G葉片類囊體特異蛋白1 140種，NIL-Y葉片類囊體特異蛋白700種。其中，NIL-G葉片類囊體蛋白涉及光合作用和天線蛋白的共有20種，參與PSⅡ、ATPase、PSⅠ和光合電子傳遞鏈；NIL-Y葉片類囊體蛋白中參與光合作用和天線蛋白的共有7種，僅涉及PSⅡ和ATPase。