尹晟，傅鈺，龍鴻

擬南芥葉片衰老突變體延遲營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變

尹晟，傅鈺，龍鴻通信作者

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300392）

高等植物營養(yǎng)生長階段根據(jù)能否誘導(dǎo)開花分為前期的幼齡期和后期的成熟期，其轉(zhuǎn)變過程稱為營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變。營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變和營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，都是植物生長發(fā)育過程中的重要生理過程，均與植物自身發(fā)育的時間進(jìn)程相關(guān)，受到一些共同的基因調(diào)控，而葉片衰老相關(guān)基因在營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變中的調(diào)控作用仍不明確。本文研究了葉片衰老相關(guān)基因和的突變體營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變特點。蓮座葉葉形、遠(yuǎn)軸面表皮毛產(chǎn)生時間、葉基角特征等形態(tài)觀測表明，擬南芥突變體延遲了營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變。對植株生長發(fā)育不同階段的、表達(dá)水平檢測表明，和的表達(dá)量分別呈下降和上升的趨勢，導(dǎo)致營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變延遲。突變體由于葉片衰老進(jìn)程受到影響，其發(fā)育遲緩，暗示和可能通過及表達(dá)水平來調(diào)控營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變。

營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變；葉片衰老基因；；；擬南芥

高等植物的營養(yǎng)生長包括幼齡期（juvenile stage）和成熟期（adult phase），從幼齡期到成熟期的轉(zhuǎn)變被稱為營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變（vegetative phase change，VPC），高等植物只有經(jīng)歷營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變，才具備生殖能力，進(jìn)而完成生活史。

在擬南芥生長過程中，幼齡期植株葉片呈圓形，葉柄較長，葉邊緣光滑，表皮毛僅分布在近軸面；當(dāng)植株從幼齡期開始向成熟期轉(zhuǎn)變，葉片逐漸呈現(xiàn)成熟特征，葉形呈橢圓狀，葉柄變短，葉邊緣呈鋸齒狀，近軸面和遠(yuǎn)軸面上均有表皮毛出現(xiàn)[1]。葉基角在成熟期也比幼齡期明顯增大[2]。研究表明，小分子RNA156（）及其靶基因（SQUAMOSA Promoter binding protein-like）家族，參與植物的生長發(fā)育進(jìn)程調(diào)控，是VPC發(fā)生的標(biāo)記。隨著植株的生長發(fā)育，表達(dá)量逐漸降低，而靶基因表達(dá)量逐漸增大，完成從幼齡期到成熟期的轉(zhuǎn)變[3]。

果樹生長發(fā)育也經(jīng)歷了VPC的過程，果樹的幼齡期即為生產(chǎn)上的童期，是指實生樹生長到具有開花潛能，采取任何措施都不能人工誘導(dǎo)開花的發(fā)育時期。這一時期的長短因樹種、環(huán)境條件和栽培技術(shù)而異，農(nóng)諺中有“桃三杏四李五年”的說法，由于果樹以果實為收獲目標(biāo)，童期是限制果樹從實生樹到開花結(jié)實的重要因素。除不能開花外，童期果樹也具有許多與成熟期果樹不同的生理和形態(tài)特點，如葉緣的形狀表現(xiàn)為缺刻，莖上多棘刺等，實生樹的童期雖然不能消除，但可縮短。

葉片衰老是植物正常的生理過程。是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活下游的乙烯響應(yīng)基因[4]，進(jìn)一步影響葉片衰老。是多種植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路共用的關(guān)鍵因子[5]，基因編碼一個包含F(xiàn)-box的蛋白質(zhì)，F(xiàn)-box是泛素E3連接酶復(fù)合體的重要組分，通過泛素介導(dǎo)的蛋白水解來控制葉片的壽限，它結(jié)合了延遲衰老需要的蛋白并可將其水解[6]。和均參與葉片衰老進(jìn)程的調(diào)控，與植物發(fā)育的時間進(jìn)程相關(guān)，但對營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的作用仍不清楚。

本文研究擬南芥突變體的VPC過程，旨在探討基因?qū)τ赩PC的影響，為擬南芥中葉片衰老與VPC之間的關(guān)聯(lián)提供試驗依據(jù)，為進(jìn)一步探索果樹幼齡期（童期）生長發(fā)育的基因調(diào)控和時相轉(zhuǎn)變提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥（L.）野生型Col-0種子由天津農(nóng)學(xué)院果樹學(xué)重點實驗室保存。WT- Col背景下的（CS8052）、（CS9565）突變體種子購自美國俄亥俄州立大學(xué)的Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 試驗方法

1.2.1 植株種植

植株種植方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 擬南芥形態(tài)學(xué)觀察

待種子長出子葉后，開始觀察記錄野生型Col-0及突變體的形態(tài)學(xué)特征，包括：植株的蓮座葉數(shù)量，蓮座葉葉形及最早出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉序數(shù)，蓮座葉葉長寬比及葉基角，使用DWRuler軟件測量葉片及葉柄之間形成的葉基角，并計算植株生長速率。

1.2.3 熒光定量PCR

采用實時熒光定量PCR儀（BIO-RAD CFX96）和大連寶生物熒光定量試劑（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）進(jìn)行檢測。提取野生型及突變體生長發(fā)育階段各時期的葉片組織RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作樣品模板，每個樣品重復(fù)3次，內(nèi)參基因為，對植株葉片中調(diào)控基因和靶基因的表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR檢測。擴增采用頸環(huán)法，引物序列：-F：5′-GCTGAGAGATTCAGATGCCCA-3′，-R：5′-GTGGATTCCAGCAGCTTCCATACT-3′，-F：5′-CATCTTGTAGATCTCTGAAGTTG GACT-3′，-R：5′-GAGATTGAGACATA GAGAACGAAGACA-3′，-F：5′-TGAGAA GAAGCAAAGCGGAA-3′，-R：5′-TATCCG CGGTACAACTCTCG-3′。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉形分析及出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛的蓮座葉

為分析突變體的VPC進(jìn)程，課題組進(jìn)行了野生型及突變體的形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果表明，野生型營養(yǎng)生長時間為20 d，蓮座葉總數(shù)為11片，在第6片蓮座葉（第15天）時葉緣出現(xiàn)明顯鋸齒、葉片伸長并出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛；與之相對應(yīng)，突變體和的營養(yǎng)生長時間分別為28 d和33 d，蓮座葉總數(shù)分別為15片和14片，分別在第7片（第18天）和第7片（第21天）蓮座葉時出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛（圖1，表1）。這些結(jié)果說明，突變體較野生型VPC被延遲。

圖1 野生型和突變體ein3、max2的蓮座葉葉形圖

注：A：野生型蓮座葉葉形；B：突變體蓮座葉葉形；C：突變體蓮座葉葉形。箭頭示出現(xiàn)遠(yuǎn)軸面表皮毛，標(biāo)尺＝1 cm

表1 野生型和突變體ein3、max2蓮座葉發(fā)育狀況比較

注：營養(yǎng)生長時間指從播種日期到植株出現(xiàn)可見花芽的時間。與野生型分別進(jìn)行對比，用檢驗法對統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析，*代表差異顯著（0.01＜≤0.05），**代表極差異顯著（0.01）。下同

2.2 葉片長寬比

為進(jìn)一步分析突變體的VPC進(jìn)程，測量并計算了野生型與突變體的葉片長寬比。結(jié)果表明，野生型及突變體的蓮座葉長寬比均呈上升趨勢，其中野生型在第6片長寬比明顯增大后趨于穩(wěn)定上升，說明此時發(fā)生VPC；而突變體均在第7片長寬比明顯增大后趨于穩(wěn)定上升（圖2A，2B），說明突變體在此時發(fā)生VPC，比野生型VPC延遲。

圖2 野生型和突變體ein3、max2葉片長寬比值

注：A、B折線圖分別為對應(yīng)生長時期的野生型與突變體的蓮座葉葉片長寬比

2.3 葉基角變化

通過測量并計算野生型和突變體蓮座葉葉片葉基角發(fā)現(xiàn)，在植株生長過程中，其葉片基角也隨之發(fā)生變化。選取第3、5、7、9片蓮座葉，測量并計算其葉片基角進(jìn)行差異比較。在第5和第7片蓮座葉，野生型葉基角分別為121.45°和126.58°，突變體分別為108.16°、115.27°；突變體分別為104.23°、114.60°（表2），突變體葉基角均明顯小于野生型，說明突變體與野生型相比均發(fā)生VPC延遲。

表2 野生型與突變體ein3、max2植株葉片基角的比較

2.4 miR156及SPL3表達(dá)分析

q-PCR結(jié)果顯示，隨著植株的生長發(fā)育，野生型和突變體各發(fā)育階段的表達(dá)量均呈下降的趨勢（圖3），野生型在第15天時表達(dá)量顯著下降，突變體和分別在19天（圖3A）和21天（圖3B）時表達(dá)量明顯下降，突變體中表達(dá)量均比野生型高。此外，野生型和突變體各發(fā)育階段的表達(dá)量均呈上升趨勢（圖3），野生型在第15天時表達(dá)量顯著上升約3倍，突變體的表達(dá)量均比野生型低，突變體和分別在第19天（圖3C）和第21天（圖3D）時表達(dá)量顯著上升約2倍，隨后持續(xù)增長，直至分別生長到第28天（圖3C）、33天（圖3D）出現(xiàn)花芽時達(dá)到峰值，說明突變體和2分別在第18天和第21天發(fā)生VPC，對比野生型發(fā)生VPC時間（第15天），突變體均發(fā)生VPC時間延遲。

圖3 突變體ein3、max2中miR156和SPL3的表達(dá)水平q-PCR檢測

注：A和B為和中的表達(dá)水平；C和D為和中的表達(dá)水平

3 討論與結(jié)論

營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變是植物生長發(fā)育中的一個重要生理過程，也是必不可少的階段，其遺傳調(diào)控機理尚不完全清楚。一類小分子RNA，、等作為植物發(fā)育時間進(jìn)程的調(diào)節(jié)因子，不僅在植物的VPC過程中起作用，也在成花誘導(dǎo)中起作用[8-11]。研究表明，通過抑制10個基因起作用，超表達(dá)植株顯示，這些基因調(diào)控植物發(fā)育和生理的許多方面，和對VPC和營養(yǎng)生長至生殖生長時相轉(zhuǎn)變起作用，和則對花分生組織轉(zhuǎn)變起作用[12]。此外，通過作用于細(xì)胞核中的信號因子參與調(diào)控VPC[13]。本研究也表明，通過和協(xié)同作用，參與調(diào)控和的VPC和成花轉(zhuǎn)變。

葉片生長是營養(yǎng)生長的正常過程，隨植株生長發(fā)育，葉片在衰老過程中，一些葉片衰老相關(guān)基因被激活后，表達(dá)增強，參與葉片衰老調(diào)控，包括和[14]。作為乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的一個關(guān)鍵因子，對乙烯反應(yīng)起正調(diào)控作用，促進(jìn)葉片衰老；則延遲衰老相關(guān)蛋白水解，同樣促進(jìn)衰老。突變體和中，葉片數(shù)目比野生型增多，可能是葉片衰老延遲的表現(xiàn)。擬南芥VPC產(chǎn)生過程中，遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生是一個形態(tài)學(xué)標(biāo)志，但其分子機制仍不清楚。最近研究表明，由于（）中的3＇非編碼區(qū)域的G突變?yōu)锳，加速了遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生。一個作用于調(diào)控途徑下游的類轉(zhuǎn)錄因子蛋白TOE1抑制了基因表達(dá)[15]?？梢姡h(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生與調(diào)控途徑相關(guān)。本研究中，突變體遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生與基因表達(dá)調(diào)控VPC進(jìn)程結(jié)果相一致，說明突變體VPC延遲的同時，也從一個側(cè)面說明遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生與基因表達(dá)調(diào)控存在相關(guān)性。

植株在生長發(fā)育過程中，器官形態(tài)上的變化受到基因表達(dá)的調(diào)控，營養(yǎng)生長是由細(xì)胞內(nèi)外因子調(diào)控蛋白來調(diào)控的一個多細(xì)胞協(xié)同生長的過 程[16]。研究表明，在植物莖發(fā)育早期中積累于莖端分生組織中起作用，而基因則通過抑制（）基因表達(dá)來調(diào)控分生組織的大小，和基因共同作用，調(diào)控植物生長發(fā)育的時間進(jìn)程[17]。和基因共同作用，依靠表達(dá)量上的閾值（Threshold）來調(diào)控VPC進(jìn)程[18]，這與課題組的q-PCR檢測結(jié)果一致。前期工作也表明，通過莖端分生組織的形態(tài)變化來調(diào)控VPC的過程[19]。

VPC是一個綜合調(diào)控的結(jié)果，是植物隨生長發(fā)育時間進(jìn)程而產(chǎn)生的生理過程，從漸進(jìn)到量變，具有累積效應(yīng)。和基因是VPC進(jìn)程的調(diào)控主線（main pathway），其他與發(fā)育時間相關(guān)的基因以及表觀遺傳因子[20-22]也可能參與其中，這有待更多的試驗驗證。

[1] TELFER A，BOLLMAN K M，POETHIG R S. Phase change and the regulation of trichome distribution in[J].Development，1997，124（3）：645-654.

[2] LI S，YANG X，WU F，et al. HYL1 controls themiR156- mediated juvenile phase of vegetative growth[J]. Journal of Experimental Botany，2012，63（7）：2787-2798.

[3] WU G，POETHIG R S. Temporal regulation of shoot development inbyand its target[J]. Development，2006，133（18）：3539-3547.

[4] 徐倩，殷學(xué)仁，陳昆松. 基于乙烯受體下游轉(zhuǎn)錄因子的果實品質(zhì)調(diào)控機制研究進(jìn)展[J]. 園藝學(xué)報，2014，41（9）：1913-1923.

[5] STIMBERG P，F(xiàn)URNER I J，LEYSER H M O. MAX2 participates in an SCF complex which acts locally at the node to suppress shoot branching[J]. Plant Journal，2007，50（1）：80-94.

[6] WOO H R，CHUNG K M，Park J Het al. ORE9，an F-box protein that regulates leaf senescence in[J]. Plant Cell，2001，13（8）：1779-1790.

[7] 盧陽，龍鴻. 擬南芥葉片數(shù)目變化突變體對營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變的影響[J]. 植物學(xué)報，2015，50（3）：331-337.

[8] CAO D，LI Y，WANG J，et al. GmmiR156b overexpression delays flowering time in soybean[J]. Plant Molecular Biology，2015，89：353-363.

[9] GUO C，XU Y，SHE M，et al. Repression of miR156 by miR159 regulates the timing of the juvenile-to-adult transition in[J]. The Plant Cell，2017，29：1293-1304.

[10] FENG S，XU Y，GUO C. Modulation of miR156 to identify traits associated with vegetative phase change in tobacco（）[J]. Journal of Experimental Botany，2016，67（5）：1493-1504.

[11] LEICHTYA A R，POETHIG R S. Development and evolution of age-dependent defenses in ant-acacias[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（31）：15596-15601.

[12] XU M，HU T，ZHAO J，et al. Developmental functions of miR156-regulated（）genes in[J]. PLOS Genetics，2016，12（8）：e1006263.

[13] ZHANG H，ZHANG L，HAN J，et al. The nuclear localization signal is required for the function of squamosal promoter binding protein?like gene 9 to promote vegetative phase change in[J]. Plant Molecular Biology，2019，100：571-578.

[14] GAN S，AMASINO R M. Making sense of senescence：molecular genetic regulation and manipulation of leaf senescence[J]. Plant Physiology，1997，113：313-319.

[15] XU Y，QIAN Z，ZHOU B，et al. Age-dependent heteroblastic development of leaf hairs in[J]. New Phytologist，2019，224：741-748.

[16] SALEM M A，LI Y，BAJDZIENKO K，et al. RAPTOR controls developmental growth transitions by altering the hormonal and metabolic balance[J]. Plant Physiology，2018，177：565-593.

[17] FOURACREA J P，POETHIG R S. Role for the shoot apical meristem in the specification of juvenile leaf identity in[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2019，116（20）：10168-10177.

[18] HE J，XU M，WILLMANN M R，et al. Threshold- dependent repression ofgene expression by miR156/miR157 controls vegetative phase change in[J]. PLOS Genetics，2018，14（4）：e1007337.

[19] 郭蕊，傅鈺，馬婉琪，等. 擬南芥生物鐘突變體延遲營養(yǎng)生長時相轉(zhuǎn)變[J]. 生物學(xué)雜志，2018，35（3）：15-18.

[20] XU Y，GUO C，ZHOU B，et al. Regulation of vegetative phase change by SWI2/SNF2 chromatin remodeling ATPase BRAHMA[J]. Plant Physiology，2016，172：2416-2428.

[21] XU M，HU T，SMITH M R，et al. Epigenetic regulation of vegetative phase change in[J]. The Plant Cell，2016，28（1）：28-41.

[22] XU Y，ZHANG L，WU G. Epigenetic regulation of juvenile-to-adult transition in plants [J]. Frontiers in Plant Science，2018，9：1048.

The vegetative phase changedelay by leaf senescence related mutantsand

Yin Sheng, Fu Yu, Long HongCorresponding Author

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In higher plants, vegetative phase change refers to the transition from juvenile to adult phase, and after that plants can blossom. The vegetative phase change and the transition from vegetative growth to reproductive growth are important physiological processes in plant growth and development. Both processes are related to the timespan of plant development, sharing some regulated genes. However, regulation of leaf senescence related genes during this transition remains unknown. This study investigated the characteristics of vegetative phase change via leaf senescence related mutantsand. Morphological observations of rosette leaf shape, onset of abaxial trichomes, blade base angles showed that vegetative phase change was delayed inandExpression levels ofandat different stages ofplant development showed down-regulated and up-regulated trend,leading toa delayed vegetative phase change.Compared with wild types, mutant plants developed slowly, due to the ongoing leaf senescence. The data suggested thatandmay play a role in regulating plant vegetative phase change through expression levels ofand．

vegetative phase change;leaf senescence gene;;;

1008-5394（2020）04-0007-05

10.19640/j.cnki.jtau.2020.04.002

Q945.4

A

2020-04-02

天津農(nóng)學(xué)院研究生培養(yǎng)質(zhì)量提升項目（101018）

尹晟（1994—），男，碩士在讀，主要從事果樹遺傳方面的研究。E-mail：554182342@qq.com。

龍鴻（1964—），男，教授，博士，主要從事果樹遺傳、發(fā)育生物學(xué)的研究。E-mail：longhong@tjau.edu.cn。

責(zé)任編輯：楊霞