李騰輝，董一昕，閆鳳娜，王淑艷，王珊珊，于 雪，王 旭，許明陽，李衛(wèi)紅*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京100029；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100020）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為氣是構(gòu)成人體和維持人體生命活動(dòng)的最基本物質(zhì)，人體的精微物質(zhì)血、津液和精等均由氣所化生[1]。氣通過推動(dòng)、溫煦作用，對(duì)人體的生長(zhǎng)發(fā)育以及各臟腑組織器官的生理活動(dòng)均具有激發(fā)和促進(jìn)作用[2]。線粒體通過氧化磷酸化過程合成ATP，為細(xì)胞的各種生命活動(dòng)提供能量，是人體“動(dòng)力工廠”。當(dāng)線粒體功能障礙時(shí)，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)“氣虛”的相關(guān)癥狀。由于中醫(yī)“氣”和線粒體在功能和病理表現(xiàn)上的高度一致性，有學(xué)者提出了“氣-線粒體”相關(guān)學(xué)說[3-4]，提示改善線粒體損傷可能是補(bǔ)氣藥物發(fā)揮療效的內(nèi)在機(jī)制。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝旺盛，能量需求高，神經(jīng)細(xì)胞線粒體含量豐富[5]。線粒體是除了動(dòng)物細(xì)胞核之外唯一含有DNA 的細(xì)胞器，但由于線粒體DNA（mtDNA）缺乏組蛋白的保護(hù)，極易受到氧自由基等因素?fù)p傷發(fā)生缺失突變，導(dǎo)致線粒體能量代謝功能異常[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用具有神經(jīng)細(xì)胞特征的PC12 細(xì)胞，通過建立mtDNA 部分缺失細(xì)胞模型，觀察補(bǔ)中益氣湯對(duì)線粒體損傷的作用及其內(nèi)在機(jī)制，為揭示中醫(yī)“補(bǔ)氣”療法的生物內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物

補(bǔ)中益氣湯：黃芪15 g，炙甘草15 g，人參9 g，當(dāng)歸6 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡6 g，白術(shù)9 g，均購(gòu)自北京同仁堂。補(bǔ)中益氣湯母液制備：將補(bǔ)中益氣湯飲片加適量水浸泡0.5 h，煎煮兩次，合并兩次藥液濃縮至含生藥315 mg/mL 的母液，過濾除菌4 ℃保存?zhèn)溆谩?達(dá)納康母液制備：達(dá)納康作為陽性對(duì)照藥，制備成總有效成分0.4 mg/mL 的母液，4 ℃保存以備用。

1.2 細(xì)胞

PC12 細(xì)胞（大鼠腎上腺嗜鉻瘤細(xì)胞株）購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM、胎牛血清(Gibco 公司)；馬血清（拜爾迪公司）；溴化乙錠（蘭博利德公司）；丙酮酸、尿嘧啶（Sigma 公司）；CCK8 試劑盒（碧云天公司）；線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ活性檢測(cè)試劑盒（索萊寶公司）；ATP 檢測(cè)試劑盒（碧云天公司）；DNA 提取試劑盒（艾科瑞公司）；RNA 檢測(cè)試劑盒（艾科瑞公司）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Eppendorf 公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）。

2 方法

2.1 PC12 細(xì)胞mtDNA 部分缺失模型建立

2.1.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 將PC12 細(xì)胞按5×105/mL 密度接種于96 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，吸棄舊培養(yǎng)基，除正常對(duì)照組外，其余各組加入不同終濃度（125、250、500、1 000、2 000 ng/mL）溴化乙錠，以及100 μg/mL 丙酮酸，50 μg/mL 尿嘧啶的培養(yǎng)基，48 h 后將細(xì)胞按照1×105/mL 密度接種于96 孔板中，每組設(shè)定6 個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行CCK8 檢測(cè)。 最終確定溴化乙錠的濃度為500 ng/mL 用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 mtDNA 拷貝數(shù)檢測(cè) 為證實(shí)mtDNA 的缺失情況，采用RT-PCR 法檢測(cè)線粒體單拷貝基因環(huán)氧合酶2（COX2）來代表mtDNA 拷貝數(shù)。500 ng/mL 濃度溴化乙錠造模完成后，收集細(xì)胞，采用DNA 提取試劑盒提取細(xì)胞DNA，檢測(cè)DNA 質(zhì)量并測(cè)定濃度。擴(kuò)增COX2 基因，引物大小為156 bp，正向引物序列為5′-TGGCTTACAAGACGCCACAT-3′，反向引物序列為5′-TGGGCGTCTATTGTGCTTGT-3′，核編碼基因β-actin 作為內(nèi)參，引物大小為262 bp，正向引物序列為：5′-TTACTGCCCTGGCTCCTAG-3′，反向引物序列為5′-CGTACTCCTGCTTGCTGATC-3′。反應(yīng)體系為2×SYBR Green Mix 10 μL，DNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，65 ℃延伸5 s，49 個(gè)循環(huán)。 采用2-△△Ct法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組與處理

將PC12 細(xì)胞分為4 組：正常組、模型組、達(dá)納康組、補(bǔ)中益氣湯組。除正常組外，其余3 組按“2.1”方法造模。造模完成后，模型組更換為無血清DMEM基本培養(yǎng)基。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出補(bǔ)中益氣湯和達(dá)納康的給藥濃度分別為16 mg/mL、100 ng/mL。補(bǔ)中益氣湯組和達(dá)納康組按照預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的藥物濃度進(jìn)行給藥干預(yù)，24 h 后進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 細(xì)胞分組處理完成后，吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS 溶液輕柔清洗2 遍，加入90 μL DMEM 培養(yǎng)基和10 μL CCK8 檢測(cè)液，37 ℃孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在450 nm 處的OD 值。

2.3.2 線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性和ATP 含量測(cè)定 細(xì)胞分組處理完成后，用線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性檢測(cè)試劑盒及ATP 檢測(cè)試劑盒，比色法檢測(cè)各組細(xì)胞線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書上的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。

2.3.3 線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（mitochondrial transcription factor A, TFAM）mRNA 水平檢測(cè) 各組藥物作用完成后，收集細(xì)胞，采用RNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定RNA 濃度并檢測(cè)純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃，15 min；85 ℃，4 s，TFAM 引 物 大 小 為148 bp， 正向引物序列為5′-TTAGAGAAGGAAGC CCGGCA-3′， 反 向 引 物 序 列 為5′-GTGACTCATC CTTAGCCCCC-3′。內(nèi)參GAPDH 引物大小為153 bp，正向引物序列為5′-CCATTCTTCCACCTTTGAT-3′，反向引物序列為5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACT-3′。反應(yīng)體系為2×SYBR Green Mix 10 μL，cDNA 1 μL，引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL，反應(yīng)程序及結(jié)果計(jì)算方法同“2.1.2”。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 mtDNA 部分缺失模型中溴化乙啶濃度的確定

與正常組比較，溴化乙啶各濃度組OD 值均降低(P＜0.001)，呈現(xiàn)出線性量效關(guān)系，表明溴化乙錠引起線粒體活性下降。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于溴化乙錠對(duì)細(xì)胞毒性較大，1 000 ng/mL、2 000 ng/mL 濃度組細(xì)胞造模后死亡較多，藥物治療很難挽救，故選擇中間劑量500 ng/mL 溴化乙啶作為本實(shí)驗(yàn)的造模濃度。見表1。

表1 不同濃度溴化乙啶對(duì)PC12 細(xì)胞活性的影響（±s,n=6）

表1 不同濃度溴化乙啶對(duì)PC12 細(xì)胞活性的影響（±s,n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.001

組別正常組125 ng/mL 250 ng/mL 500 ng/mL 1 000 ng/mL 2 000 ng/mL OD 值1.55±0.07 0.77±0.05**0.50±0.05**0.41±0.06**0.35±0.02**0.33±0.02**

3.2 mtDNA 拷貝數(shù)檢測(cè)

正常組細(xì)胞形態(tài)呈橢圓狀或錐形，折光性良好，細(xì)胞貼壁性好，有聚成小團(tuán)簇狀生長(zhǎng)的傾向（圖1A）；模型組細(xì)胞貼壁性較差，部分細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中，提示出現(xiàn)細(xì)胞損傷狀態(tài)（圖1B）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)圖（×100）

與正常組相比，模型組PC12 細(xì)胞COX2 基因表達(dá)明顯下降（P＜0.01），提示mtDNA 拷貝數(shù)下降，表明500 ng/mL 濃度溴化乙錠造模造成了PC12 細(xì)胞線粒體部分DNA 缺失。 見圖2。

3.3 各組細(xì)胞線粒體活性的檢測(cè)結(jié)果

圖2 mtDNA 拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組細(xì)胞線粒體活性顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，達(dá)納康組和補(bǔ)中益氣湯組細(xì)胞活性顯著升高（P＜0.01），提示補(bǔ)中益氣湯可以改善mtDNA 缺失造成的細(xì)胞活性下降。 見表2。

表2 各組PC12 細(xì)胞線粒體活性檢測(cè)結(jié)果（±s,n=10）

表2 各組PC12 細(xì)胞線粒體活性檢測(cè)結(jié)果（±s,n=10）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

組別正常組模型組達(dá)納康組補(bǔ)中益氣湯組OD 值2.27±0.27 0.52±0.11**2.02±0.22▲▲2.14±0.17▲▲

3.4 線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性均顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，達(dá)納康組和補(bǔ)中益氣湯組線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性顯著升高（P＜0.01），復(fù)合物Ⅲ活性有升高趨勢(shì)，但組間無顯著差異，結(jié)果見圖3。

3.5 各組細(xì)胞線粒體ATP 含量

與正常組比較，模型組細(xì)胞ATP 含量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)；與模型組比較，達(dá)納康組和補(bǔ)中益氣湯組細(xì)胞線粒體ATP 含量顯著回升(P＜0.001)，表明兩種藥物干預(yù)后細(xì)胞線粒體能量代謝功能有所恢復(fù)。 見表3。

3.6 TFAM mRNA 表達(dá)水平

與正常組比較，模型組TFAM mRNA 表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，達(dá)納康組和補(bǔ)中益氣湯組TFAM mRNA 表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。 見圖4。

4 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為氣是一種肉眼不可見的精微物質(zhì)，可以通過生理功能和病理現(xiàn)象來感知生命物質(zhì)的存在[7]。 現(xiàn)代研究認(rèn)為，線粒體是細(xì)胞進(jìn)行能量代謝的主要場(chǎng)所，線粒體呼吸鏈經(jīng)過一系列的電子和氫離子傳遞產(chǎn)生ATP，可以為細(xì)胞生存提供95%以上能量，對(duì)所在組織、器官和生命質(zhì)量產(chǎn)生重要影響[8]。正如氣一樣人體生命狀態(tài)會(huì)隨著線粒體功能的變化而改變，線粒體也載負(fù)著生命現(xiàn)象。故中醫(yī)學(xué)中的氣與線粒體功能和作用的統(tǒng)一性逐漸成為現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)者的共識(shí)[7-9]。

表3 各組細(xì)胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

表3 各組細(xì)胞ATP 含量（±s,n=6,nmol·L-1）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01

ATP 含量836.16±12.76 244.17±8.00**804.60±13.55▲▲815.70±16.70▲▲組別正常組模型組達(dá)納康組補(bǔ)中益氣湯組

圖4 各組TFAM mRNA 表達(dá)水平

腦為“元神之府”，主宰人體的生命活動(dòng)。隨著機(jī)體衰老，髓減腦消，神機(jī)失用會(huì)對(duì)人的生活質(zhì)量造成極大的影響。有報(bào)道指出，老年小鼠的腦和海馬組織內(nèi)mtDNA 缺失的比例較青年幼鼠明顯增加，mtDNA缺失與年齡相關(guān)的退行性病變的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。由于mtDNA 沒有內(nèi)含子，任何形式的突變都可能會(huì)造成mtDNA 序列改變，導(dǎo)致線粒體能量生成障礙，出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能降低、精神意識(shí)障礙等現(xiàn)象[12]。因此，有人認(rèn)為mtDNA 突變可能是導(dǎo)致衰老和神經(jīng)退行性疾病的重要因素[13]。為探討大腦mtDNA 缺失對(duì)線粒體的功能影響，本實(shí)驗(yàn)采用PC12 大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤分化細(xì)胞株（它具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一般特征，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)藥理研究）建立了mtDNA 部分缺失細(xì)胞模型。造模采用經(jīng)典的溴化乙錠誘導(dǎo)法，溴化乙錠可插入mtDNA 內(nèi)部，逐步減少mtDNA 的復(fù)制，但不影響核DNA 的復(fù)制[14]。 以往線粒體mtDNA 研究多采用線粒體缺失細(xì)胞株Rho0(ρ0)，即通過長(zhǎng)時(shí)間的溴化乙錠干預(yù)造成mtDNA 完全缺失[15]，這種“全或無”細(xì)胞模型無法研究mtDNA不同拷貝數(shù)對(duì)疾病的影響，不適用于衰老、疲勞綜合征等線粒體部分受損疾病的研究[16]。 故本實(shí)驗(yàn)采用500 ng/mL 濃度的溴化乙錠進(jìn)行造模，并通過檢測(cè)mtDNA 拷貝數(shù)證實(shí)該濃度可造成mtDNA 部分缺失，建立更適于中醫(yī)“氣虛證”相關(guān)疾病研究的mtDNA 部分缺失模型。

線粒體呼吸鏈通過一系列遞氫、遞電子反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)形成能量提供給細(xì)胞[17]，一定程度上體現(xiàn)了氣的推動(dòng)作用。 本實(shí)驗(yàn)采用李東垣創(chuàng)立的補(bǔ)氣代表方“補(bǔ)中益氣湯”作為治療藥物[18-19]，觀察它對(duì)線粒體功能的影響。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在到達(dá)最佳給藥濃度之前，補(bǔ)中益氣湯組和達(dá)納康組細(xì)胞活性會(huì)隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)，之后二者呈反比關(guān)系，提示兩個(gè)治療藥物在一定范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活性有改善作用。與正常組相比，模型組的線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性和ATP 含量明顯下降，提示mtDNA部分缺失導(dǎo)致線粒體呼吸功能障礙可能與這3 個(gè)復(fù)合物有關(guān)。線粒體復(fù)合物Ⅰ的7 個(gè)亞基、復(fù)合物Ⅳ的2 個(gè)亞基和ATP 合酶F0 結(jié)構(gòu)的2 個(gè)亞基由mtDNA自己編碼，受mtDNA 缺失影響較大。 與模型組相比，補(bǔ)中益氣湯可顯著增強(qiáng)呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ活性，這可能是補(bǔ)中益氣湯改善線粒體功能的作用環(huán)節(jié)之一。復(fù)合物Ⅰ主要把氫或電子從輔酶I（NADH）傳遞給輔酶Q（CoQ），同時(shí)將4 個(gè)氫離子從線粒體內(nèi)膜內(nèi)側(cè)泵到膜間隙，復(fù)合體Ⅱ的主要功能是將電子從琥珀酸傳遞給CoQ，然后傳遞給復(fù)合物Ⅲ，再通過Cytc 將電子傳遞到復(fù)合體Ⅳ， 驅(qū)動(dòng)ADP 和Pi合成ATP[20]。 與模型組相比，補(bǔ)中益氣湯組ATP 含量增高，與陽性藥達(dá)納康效果相近，提示線粒體呼吸鏈整體功能改善。

TFAM 是一種由細(xì)胞核基因編碼的線粒體蛋白質(zhì)。 TFAM 可以通過包裹mtDNA，形成類似組蛋白的核樣結(jié)構(gòu)，使其免受氧化損傷，同時(shí)促進(jìn)mtDNA的復(fù)制，調(diào)節(jié)拷貝數(shù)，起到保護(hù)mtDNA 的作用[21]。線粒體功能紊亂與許多線粒體疾病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病和衰老等密切相關(guān),TFAM 在相關(guān)疾病的治療中起到了關(guān)鍵作用[22]。 有報(bào)道稱在前腦神經(jīng)細(xì)胞中TFAM 的基因敲除可導(dǎo)致mtDNA 和線粒體轉(zhuǎn)錄的減少以及嚴(yán)重的呼吸鏈缺陷，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和明顯的行為失調(diào)[23]。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，補(bǔ)中益氣湯組的TFAM 表達(dá)顯著提高，提示上調(diào)TFAM 表達(dá)可能是補(bǔ)中益氣湯發(fā)揮線粒體保護(hù)作用的內(nèi)在機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)中益氣湯對(duì)PC12細(xì)胞mtDNA 部分缺失模型的影響，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)氣藥物可能通過改善線粒體呼吸鏈功能和mtDNA 修復(fù)對(duì)線粒體損傷起到保護(hù)作用，為補(bǔ)氣藥治療mtDNA 部分缺失引起的相關(guān)疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另一方面，通過“以藥測(cè)證”的方法驗(yàn)證了中醫(yī)氣與線粒體之間的密切相關(guān)性，為揭示中醫(yī)“氣”實(shí)質(zhì)提供了證據(jù)支撐。