翟 紅，劉永文，宋亞萍

(山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，037009)

多巴胺(dopamine,DA)是一種兒茶酚胺，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)作有重要的作用。人的快樂、認(rèn)知和精細(xì)運(yùn)動(dòng)控制均與DA 有關(guān)。DA 功能障礙是一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如帕金森病、亨廷頓病、抑郁癥、精神分裂癥等)的發(fā)病原，研究快速、靈敏、高選擇性的多巴胺測(cè)定方法，對(duì)于生命科學(xué)、生物藥物及臨床檢驗(yàn)等具有重要意義[1-2]。現(xiàn)有的多巴胺測(cè)定方法有比色法[3-4]、化學(xué)發(fā)光法[5]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[6-7]、電化學(xué)法[8-10]等。以上方法作為經(jīng)典的檢測(cè)手段被廣泛應(yīng)用,但是它們所需的儀器設(shè)備較昂貴,操作人員需要掌握全面的知識(shí)和技術(shù),此外樣品的前處理也很復(fù)雜,這些大大制約了它們的實(shí)用性。熒光法因其操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度快等，已被用于多巴胺的檢測(cè)[11-13]。但只采用單一的熒光信號(hào)檢測(cè)多巴胺時(shí)，由于環(huán)境、儀器等條件的改變，影響檢測(cè)結(jié)果，因此，尋找合適的參比信號(hào)，構(gòu)建熒光比率型傳感器意義重大。我們采用谷胱甘肽作穩(wěn)定劑制備熒光金簇（AuGSH），并將其與間苯二酚相結(jié)合構(gòu)建了新型的熒光比率傳感器用于多巴胺的準(zhǔn)確檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

所有試劑均為分析純：間苯二酚購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)、四氯金酸三水合物(HAuCl4·3H2O)、鹽酸多巴胺(DA)及三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購(gòu)自上海阿拉丁公司。主要儀器有：LS-55 熒光分光光度計(jì)（PE 公司），Lambda 35紫外分光光度計(jì)（PE 公司），ZF7-三用紫外分析儀（鞏義市科瑞儀器有限公司），HC 2062 高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 熒光納米金簇（AuGSH）的合成

將1 g HAuCl4·3H2O 溶于100 mL 超純水中，配成濃度為0.01 g/mL 的溶液，作為貯備液。取2 mL 貯備液加入3 mL 超純水，待用。稱取0.016 9 g GSH，溶于5 mL超純水中。將二者合并于一個(gè)干凈的具塞試管（用王水浸泡24 h 后清洗烘干）中，此時(shí)HAuCl4與GSH 的摩爾比為1∶1，放置10 min，待到溶液變?yōu)闊o色透明，放置90 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)7h。常溫下自然冷卻，加入適量無水乙醇，以10 000 r/min 離心15 min，沉淀溶于pH=7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，冷藏，備用。

1.2.2 基于間苯二酚檢測(cè)多巴胺

取8 支2 mL 的離心管，加入不同濃度的鹽酸多巴胺溶液（0、10、25、50、75、100、500、1 000 μmol/L）200 μL，加pH=11 的PBS 至1.8 mL，然后各加入1 mmol/L 的間苯二酚200 μL，放置反應(yīng)3 min，用紫外分析儀在365 nm下觀察熒光。

1.2.3 基于金簇和間苯二酚檢測(cè)多巴胺

取10 支離心管，加入不同濃度的鹽酸多巴胺溶液（0、10、20、40、75、100、125、150、175、200 μmol/L）50 μL，加入pH=11 的PBS 緩沖液至350 μL，再依次加入100 μmol/L 的間苯二酚50 μL，AuGSH 100 μL，使總?cè)莘e為500 μL，混合均勻，放置3 min，立即測(cè)定熒光光譜。平行測(cè)定3組。

1.2.4 緩沖液的優(yōu)化

取6 個(gè)離心管，分別加入不同的緩沖液(PBS pH分別為7.4、9、10、11、12；Tris pH為9)300 μL，再依次加入100 μmol/L 的鹽酸多巴胺50 μL，1 mmol/L 的間苯二酚50 μL，AuGSH 100 μL，放置3 min 后，立即測(cè)定熒光光譜。平行測(cè)定3組。

1.2.5 時(shí)間的優(yōu)化

取1個(gè)離心管，依次加入100 μmol/L的鹽酸多巴胺50 μL，pH=11的PBS緩沖液300 μL，1 mmol/L 的間苯二酚50 μL，AuGSH 100 μL，總?cè)莘e為500 μL。反應(yīng)物每隔1 min測(cè)定一次熒光光譜，測(cè)至7 min。平行測(cè)定3組。

1.2.6 間苯二酚的優(yōu)化

取離心管7 支，分別加入不同濃度的間苯二酚（10、300、600、1 000、2 500、5 000、10 000 μmol/L）50 μL，再依次加入100 μmol/L 的鹽酸多巴胺溶液50 μL，pH=11的PBS緩沖液300 μL，AuGSH 100 μL，混合均勻，放置3 min 后，立即測(cè)定熒光光譜。平行測(cè)定3 組。

1.2.7 選擇性實(shí)驗(yàn)

取離心管15支，加入pH=11的PBS緩沖液345 μL，60 μmol/L 的間苯二酚50 μL，AuGSH 100 μL，加入0.1 mol/L 的離子或糖類等常見干擾物溶液（空白、Na+、Mg2+、Al3+、K+、Ca2+、Fe3+、NH4+、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、脲酸）5 μL，混合均勻，放置3 min后，立即測(cè)定熒光光譜。平行測(cè)定3組。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外吸收光譜表征與熒光表征

AuGSH在日光燈下為淡黃色澄清液體（圖1 A），其紫外吸收峰位于393 nm（圖2）；將AuGSH置于365 nm的紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)AuGSH 顯橙色熒光（圖1B），其熒光峰位于588 nm（圖3c）。此外，多巴胺和間苯二酚在堿性條件下可產(chǎn)生熒光，而且，隨著多巴胺濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)（圖4）；將多巴胺(終濃度10 μmol/L)、間苯二酚(終濃度10 μmol/L)和AuGSH (100 μL)混合3 min 后，熒光光譜顯示2 個(gè)互不干擾的熒光峰（圖3d）；與AuGSH熒光光譜相比，混合后金簇的熒光基本不變（圖3 c,d）。因此，可將AuGSH 作為參比熒光信號(hào)，結(jié)合間苯二酚構(gòu)建簡(jiǎn)單的雙發(fā)射熒光比率傳感器用于準(zhǔn)確檢測(cè)多巴胺。

此外，從紫外吸收光譜（圖2）和熒光光譜（圖3）可知，多巴胺（1 mmol/L）和間苯二酚（1 mmol/L）在380～700 nm 的范圍內(nèi)均無明顯紫外和熒光峰，說明這兩種物質(zhì)不會(huì)影響多巴胺的檢測(cè)。

圖1 AuGSH在日光燈（A）和365nm紫外燈（B）下的照片

圖2 多巴胺（a）、AuGSH（b）及間苯二酚（c）的紫外吸收光譜

圖3 多巴胺(a)、間苯二酚(b)、AuGSH(c)及三者混合液(d)的熒光光譜

圖4 間苯二酚（1 mmol/L）與不同濃度多巴胺的產(chǎn)物在365 nm紫外燈下的照片

2.2 基于金簇和間苯二酚檢測(cè)多巴胺

間苯二酚和多巴胺的反應(yīng)產(chǎn)物（DR）的熒光強(qiáng)度隨著多巴胺濃度的增加而增加，而AuGSH的熒光強(qiáng)度基本保持不變。將AuGSH的熒光作為參比值，通過計(jì)算DR和AuGSH的熒光比率（F455/F588），并將其與多巴胺的濃度進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，熒光比率（F455/F588）和多巴胺在1～10 μmol/L 和10～20 μmol/L 2個(gè)濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，線性方程分別為y=0.706x+0.020及y=2.226x-16.80，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.98，檢出限（S/N=3）為0.23 μmol/L.

圖5 檢測(cè)不同濃度多巴胺時(shí)的熒光光譜圖

2.3 緩沖液的優(yōu)化

固定其他條件不變，選取pH=9 Tris緩沖液，pH分別為7.4、9、10、11、12 的PBS 緩沖液調(diào)節(jié)體系的酸度，以確定最佳檢測(cè)條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。由圖可得，隨著PBS 緩沖液pH 的增大，DR 的熒光強(qiáng)度逐漸增大；金簇的熒光基本保持不變。當(dāng)PBS 緩沖液的pH 為11 時(shí)，熒光比值F455/F588是最高的。因此，實(shí)驗(yàn)選擇pH為11的PBS作為體系的緩沖液。

圖6 金簇(100 μL)、多巴胺(10 μmol/L)和間苯二酚(100 μmol/L)混合液在不同緩沖液中的熒光光譜圖

2.4 時(shí)間的優(yōu)化

在對(duì)時(shí)間的優(yōu)化中，固定其他條件，讓其反應(yīng)不同的時(shí)間（1～7 min），結(jié)果見圖7?？梢钥闯觯珼R 的熒光強(qiáng)度隨著時(shí)間的增加而增加，AuGSH 的熒光強(qiáng)度基本保持不變，F(xiàn)455/F588也隨著時(shí)間增加。但是，隨著時(shí)間的增加，如果位于455 nm 處的熒光峰太強(qiáng)，導(dǎo)致處于588 nm 的熒光峰被遮蔽，綜合考慮，反應(yīng)時(shí)間選3 min為宜。

圖7 在不同時(shí)間內(nèi)檢測(cè)多巴胺（10 μmol/L）的熒光光譜圖

2.5 間苯二酚的優(yōu)化

固定其他條件不變，選取不同濃度的間苯二酚（1、30、60、100、250、500、1 000 μmol/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖8。由圖可知，DR 熒光強(qiáng)度的總體趨勢(shì)隨著間苯二酚濃度的增加先升后降，在間苯二酚的終濃度達(dá)到30 μmol/L 時(shí)達(dá)到最高，AuGSH 的熒光強(qiáng)度基本保持不變。所以，熒光比率F455/F588也先升后降，在間苯二酚的終濃度達(dá)到30 μmol/L 時(shí)達(dá)到最高。但是，如果位于455 nm 處的熒光峰太強(qiáng)，會(huì)掩蓋位于588 nm 處的熒光峰，綜合考慮，選60 μmol/L 作為間苯二酚的最佳濃度。

圖8 優(yōu)化間苯二酚濃度的熒光光譜圖

2.6 選擇性實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)該傳感器的選擇性，選擇常見的離子或糖等作為潛在干擾物，包括Na+、Mg2+、Al3+、K+、Ca2+、Fe3+、NH4+、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖、果糖、木糖、脲酸，按照2.2.7 實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖9。從圖中可以看出，當(dāng)干擾物濃度是多巴胺濃度的100倍時(shí)，檢測(cè)信號(hào)仍很弱，對(duì)多巴胺的測(cè)定基本沒有干擾，說明該傳感器的選擇性較好。

圖9 常見干擾物對(duì)多巴胺測(cè)定的影響

3 結(jié)論

多巴胺和間苯二酚在強(qiáng)堿條件下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)物（DR）發(fā)射蘭色熒光，而且蘭色熒光的強(qiáng)度隨著多巴胺濃度的增大而增大；而發(fā)射紅色熒光的納米金簇（AuGSH）在相同的條件下，熒光基本不變。因此，將AuGSH的熒光作為參比信號(hào)，DR 的熒光作為檢測(cè)信號(hào)，構(gòu)建簡(jiǎn)單、靈敏、準(zhǔn)確的熒光比率傳感器用于多巴胺的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)對(duì)主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了潛在干擾物對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，表明該傳感器具有良好的選擇性，為研制新型的多巴胺傳感器提供了一定的理論基礎(chǔ)。