鄧玉營(yíng)，黃振興，阮文權(quán)，郝衛(wèi)強(qiáng)

（1.常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

1 引言

厭氧發(fā)酵被認(rèn)為是農(nóng)作物秸稈資源化的重要途徑之一，但秸稈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，水解過(guò)程被稱(chēng)為厭氧發(fā)酵的限速步驟。因此，高效接種物有利于提高稻秸發(fā)酵效率，常見(jiàn)接種物包括沼液沼渣、堆肥、活性污泥等［1］。單一秸稈原料含氮量低，無(wú)法滿足厭氧微生物營(yíng)養(yǎng)需要，導(dǎo)致其降解效率不高，因此在工程應(yīng)用中，常添加畜禽糞便等來(lái)提高秸稈產(chǎn)甲烷效率，研究大多關(guān)注共發(fā)酵原料配比［2］、C/N 調(diào)控［3-4］、提高接種量［5］等。產(chǎn)甲烷酶活性及菌群結(jié)構(gòu)的變化等指標(biāo)有利于揭示體系發(fā)酵效率提高的機(jī)制。如在豬糞和玉米秸稈共發(fā)酵試驗(yàn)中，甲烷菌群豐度的提高是甲烷產(chǎn)率強(qiáng)化的關(guān)鍵［6］。Wang 等［7］通過(guò)菌群結(jié)構(gòu)分析了豬糞和玉米秸稈共發(fā)酵中與微生物的相互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單一原料發(fā)酵菌群結(jié)構(gòu)易受到揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs） 的影響，協(xié)同作用下降；添加豬糞提高了甲烷絲菌屬（Methanosaeta）的相對(duì)豐度，從而提高了甲烷產(chǎn)率。在豬糞與稻秸共發(fā)酵試驗(yàn)中，接種量提高改變甲烷菌群結(jié)構(gòu)，從而提高了甲烷產(chǎn)率［8］。在牛糞與玉米秸稈序批式共發(fā)酵試驗(yàn)中，工藝操作通過(guò)改變細(xì)菌結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用；但甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina） 受影響較小，與產(chǎn)甲烷效率正相關(guān)［5］。由此可見(jiàn)，畜禽糞便中含有的菌系是提高秸稈厭氧共發(fā)酵效率的關(guān)鍵［4］，然而只將牛糞菌系作為接種物來(lái)研究菌群結(jié)構(gòu)對(duì)稻秸發(fā)酵體系影響的報(bào)道并不多。

秸稈整個(gè)發(fā)酵過(guò)程是固液相微生物共同作用的結(jié)果。固相上水解菌群的變化，會(huì)導(dǎo)致酶活性的差異，影響秸稈結(jié)構(gòu)的降解［9-10］。水解后產(chǎn)生的VFAs 進(jìn)入液相，能通過(guò)互營(yíng)氧化產(chǎn)生乙酸、氫等，該過(guò)程的氧化菌主要隸屬于互養(yǎng)菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)［11］，產(chǎn)物最終被甲烷菌所利用。然而除了對(duì)豬糞與小麥秸稈共發(fā)酵過(guò)程沼渣沼液中微生物變化有過(guò)研究外［12］，很少有通過(guò)固液相菌群分析揭示秸稈發(fā)酵機(jī)制的報(bào)道。

為此，本研究設(shè)計(jì)牛糞菌系接種的批次試驗(yàn)，對(duì)稻秸厭氧發(fā)酵特性進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析產(chǎn)甲烷量分別與水解酶活性、單個(gè)VFAs 濃度變化之間的關(guān)系。并利用MiSeq 測(cè)序技術(shù)，分析固液相微生物結(jié)構(gòu)特征，討論特定功能種屬變化對(duì)秸稈水解、發(fā)酵產(chǎn)酸、互營(yíng)氧化及產(chǎn)甲烷的影響。以期為牛糞菌系接種稻秸發(fā)酵過(guò)程中微生物強(qiáng)化機(jī)制研究提供參考。

2 材料與方法

2.1 接種物和原料

接種污泥取自處理餐廚垃圾的厭氧反應(yīng)器中，通過(guò)連續(xù)投加少量葡萄糖活化，提高產(chǎn)甲烷活性?？偣腆w（total solids，TS） 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.80%，揮發(fā)性固體（volatile solid，VS） 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.65%。新鮮牛糞取自奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)，為了減少對(duì)稻秸成分測(cè)定及產(chǎn)氣的影響，通過(guò)兩層紗布濾掉固渣后獲得牛糞菌系，TS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.97%，VS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.68%。稻秸在50 ℃干燥箱中烘至恒量，粉碎后過(guò)40 目篩，TS 和VS 分別為98.46%和91.58%，保存于真空干燥袋中備用。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

接種污泥、牛糞菌系和稻秸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8%、2%和2%，對(duì)照中不添加牛糞菌系。因?yàn)榻臃N物沒(méi)有經(jīng)過(guò)脫氣處理，分別設(shè)置了不投加稻秸原料的空白試驗(yàn)。體系利用改進(jìn)的BY 提供金屬營(yíng)養(yǎng)元素［13］，主要包括1.00 mg/L FeSO4·7H2O、1.00 mg/L CoCl2·6H2O、0.30 mg/L NiSO4·6H2O 等微量元素。添加K2HPO4·3H2O（1.34 g/L）、KH2PO4（0.51 g/L） 和NaHCO3（5.00 g/L） 組成緩沖體系，使初始pH 維持在6.8～7.1。

試驗(yàn)分別在厭氧瓶和甲烷潛力測(cè)試系統(tǒng)（AMPTS） 中進(jìn)行，有效體積分別為80、250 mL，39 ℃條件下發(fā)酵44 d。每個(gè)體系設(shè)置11 個(gè)厭氧瓶作為平行試驗(yàn)，沼氣通過(guò)鋁箔袋收集。每隔4 d 各取1 個(gè)厭氧瓶，沼液用于水解酶活性、VFAs、pH指標(biāo)測(cè)定，沼渣用于計(jì)算干基質(zhì)量降解率。AMPTS 系統(tǒng)產(chǎn)生的沼氣通過(guò)4 mol/L 氫氧化鈉溶液吸收后測(cè)量甲烷體積，扣除空白試驗(yàn)的數(shù)值即為每天產(chǎn)甲烷量。發(fā)酵結(jié)束后沼渣沼液用于秸稈組分和固液相微生物分析。

2.3 指標(biāo)分析

2.3.1 常規(guī)指標(biāo)

樣品用兩層紗布過(guò)濾后，固渣TS 在105 ℃下進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)厭氧瓶中TS 的變化計(jì)算干基質(zhì)量降解率。秸稈和固渣中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素含量用A2000i 纖維分析儀測(cè)定，殘?jiān)柙?5 ℃干燥箱中烘至恒量，通過(guò)發(fā)酵前后秸稈各組分變化計(jì)算纖維素、半纖維素降解率及木質(zhì)素變化率，為了減少分析誤差，添加接種物后再測(cè)定秸稈各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。沼液水解活性通過(guò)纖維素酶或木聚糖酶活性評(píng)價(jià)，參考以前的方法［14］，每毫升上清液釋放1 μg 葡萄糖或木糖的酶量規(guī)定為1 個(gè)酶活力單位（U）。在12 000 r/min 下離心10 min，所得上清液用于指標(biāo)分析，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3 次。VFAs 使用GC-2010 Plus 氣相色譜測(cè)定，pH 則通過(guò)DELTA 320 pH 計(jì)測(cè)定。

2.3.2 MiSeq 基因測(cè)序

AMPTS中沼液在800×g 下離心15 min，沉淀為固相樣品；上清液繼續(xù)在27 000×g 下離心30 min獲得液相樣品。使用Power soil?DNA 試劑盒提取初始接種物和固液相樣品DNA，引物對(duì)338F 和806R 構(gòu)建擴(kuò)增文庫(kù)后［15］，利用MiSeq 平臺(tái)完成測(cè)序。原始序列經(jīng)加工處理，提交到NCBI，序列號(hào)為：SRP123575 （SRA），并在Silva 16S rDNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，進(jìn)行物種注釋及菌群分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 產(chǎn)甲烷分析

產(chǎn)甲烷量日變化情況如圖1 所示。對(duì)照體系最高產(chǎn)甲烷量出現(xiàn)在第1 天，為122.80 mL/d，然后迅速降低。牛糞菌系添加體系有兩個(gè)產(chǎn)甲烷峰，分別出現(xiàn)在第4 天和第38 天，最高產(chǎn)甲烷量為120.35 mL/d。通過(guò)計(jì)算，甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 為269.32 mL/g，相比對(duì)照體系的199.83 mL/g，提高了35%（表1）。

圖1 產(chǎn)甲烷量日變化情況

表1 稻秸發(fā)酵結(jié)束后甲烷產(chǎn)率、干基質(zhì)量降解率及秸稈組分變化情況

稻秸水解階段是整個(gè)發(fā)酵的限速步驟，而牛糞中含有的水解微生物有利于稻秸復(fù)雜結(jié)構(gòu)的降解［1］。添加牛糞菌系前2 天受到短暫抑制，隨后出現(xiàn)了兩次水解過(guò)程，對(duì)應(yīng)兩個(gè)產(chǎn)氣峰，稻秸甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 達(dá)到269.32 mL/g。Mussoline等［1］認(rèn)為，即使通過(guò)各種物理化學(xué)預(yù)處理，稻秸甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 也大多在92～280 mL/g 變動(dòng)。在稻秸干法連續(xù)發(fā)酵中，張敏等［4］利用鮮牛糞構(gòu)建厭氧微生物體系，在稻秸有機(jī)負(fù)荷4 kg/（m3/d）時(shí)，甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 最高達(dá)到了227.8 mL/g，但試驗(yàn)使用了“黃儲(chǔ)”破碎秸稈并添加豬糞為氮源。齊利格娃等［2］發(fā)現(xiàn)豬糞與稻秸共發(fā)酵時(shí)存在協(xié)同效應(yīng)，比例為2∶1 時(shí)所有原料甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 也只有213.4 mL/g；而單稻秸原料甲烷產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 僅為124.7 mL/g，小于本試驗(yàn)對(duì)照體系。由此可見(jiàn)，本研究牛糞菌系接種稻秸產(chǎn)甲烷具有明顯成本優(yōu)勢(shì)。

3.2 稻秸降解酶和水解酶活性

甲烷的產(chǎn)生來(lái)自稻秸的水解產(chǎn)物，因此甲烷產(chǎn)率的提高與底物降解率和各組分變化密切相關(guān)。如表1 所示，牛糞添加樣品的干基質(zhì)量降解率為41.79%，高于對(duì)照體系的39.32%。發(fā)酵結(jié)束后，固渣中纖維素和半纖維素的降解率分別為53.97%、56.14%，和對(duì)照相比，半纖維素降解相差不大，但纖維素的水解明顯高于對(duì)照體系。木質(zhì)素的苯丙烷結(jié)構(gòu)降解過(guò)程需要氧氣，在厭氧條件下難以降解［9］，本研究發(fā)酵結(jié)束后木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，變化率達(dá)353.77%。

纖維素酶和木聚糖酶活性變化如圖2 所示。牛糞菌系接種體系出現(xiàn)了兩個(gè)纖維素酶活性峰值，分別為26.54、32.68 U/mL，均值為18.82 U/mL；而對(duì)照中只在第8 天出現(xiàn)了峰值，之后快速下降，均值為15.10 U/mL。牛糞菌系接種體系中木聚糖酶活性均值為214.55 U/mL，明顯高于對(duì)照的137.45 U/mL。

圖2 纖維素酶和木聚糖酶活性的變化

稻秸的結(jié)構(gòu)表明，纖維素成分被木質(zhì)素和半 纖維素基質(zhì)包裹在內(nèi)部，阻止了水解酶的作用，而高活性的木聚糖酶降解半纖維素后暴露出微纖維結(jié)構(gòu)，有利于纖維素的水解［16］。如在高粱厭氧發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶活性峰值比纖維素外切活性提前，兩類(lèi)酶協(xié)同作用加快了高粱的水解［10］。Gu等［9］在接種牛糞稻秸發(fā)酵中，發(fā)現(xiàn)高活性的木聚糖酶提高了半纖維素降解率而且加快了纖維素的水解，使得沼氣產(chǎn)率（以VS 計(jì)） 達(dá)325.3 mL/g。本研究中木聚糖酶活性較高，半纖維素先降解，在第4 天出現(xiàn)了第1 個(gè)產(chǎn)甲烷峰；隨著稻秸結(jié)構(gòu)的裂解，在發(fā)酵后期出現(xiàn)了纖維素酶活性峰值，纖維素降解，并在第38 天出現(xiàn)了第2 個(gè)產(chǎn)甲烷峰。

3.3 VFAs 濃度和pH 的變化

單個(gè)VFAs 的積累和消耗反映了水解發(fā)酵產(chǎn)酸與產(chǎn)甲烷之間的平衡。如圖3 所示，對(duì)照體系中乙酸質(zhì)量濃度在第4 天達(dá)到峰值3.69 g/L，隨后逐漸降低。而牛糞菌系接種體系乙酸濃度在第4 天達(dá)到了4.35 g/L，說(shuō)明開(kāi)始階段水解產(chǎn)酸的速度大于產(chǎn)甲烷，導(dǎo)致乙酸積累。發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)兩個(gè)峰值，質(zhì)量濃度分別達(dá)到了4.95、3.89 g/L，36 d 后被完全利用。上述數(shù)據(jù)表明，牛糞菌系接種體系以產(chǎn)乙酸發(fā)酵為主，在短暫積累后被嗜乙酸型產(chǎn)甲烷途徑消耗，其濃度與產(chǎn)甲烷活性緊密相關(guān)，該現(xiàn)象與一些秸稈發(fā)酵產(chǎn)甲烷的代謝類(lèi)型一致［14，17-19］。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中單個(gè)VFA 濃度和pH 的變化

牛糞菌系接種體系開(kāi)始階段出現(xiàn)了丙酸積累，4 d 后達(dá)1.63 g/L，高于對(duì)照體系的1.12 g/L。最高濃度出現(xiàn)在第12 天，為3.65 g/L，20 d 后濃度下降為0，而丁酸則在16 d 后濃度下降為0。對(duì)照體系中丙酸和丁酸最高濃度大于接種體系，分別達(dá)4.42、1.98 g/L。一般認(rèn)為，丙酸和丁酸是水解過(guò)程產(chǎn)生的還原氫來(lái)不及被利用的產(chǎn)物，只有通過(guò)互營(yíng)氧化作用才能克服熱力學(xué)障礙，而氧化菌生長(zhǎng)緩慢，因此易導(dǎo)致體系的酸化［11］。本研究牛糞菌系接種開(kāi)始階段丙酸積累表明了嗜氫型產(chǎn)甲烷受到抑制，這也解釋了體系直到第4 天才出現(xiàn)第1次產(chǎn)甲烷峰。同時(shí)這也是pH 在第20 天時(shí)降至6.73 的原因，但共接種物中含有的互營(yíng)氧化菌群能利用丙酸和丁酸，使得pH 在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中均值維持在7.48，處于適宜的產(chǎn)甲烷范圍［6］。

3.4 微生物結(jié)構(gòu)特征

發(fā)酵結(jié)束后細(xì)菌結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上相對(duì)豐度的變化如圖4 所示，其中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes） 和熱袍菌門(mén)（Thermotogae）在發(fā)酵后固液相中都占主導(dǎo)地位。擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes） 和WWE1 在液相中含量提高明顯，而綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、變形菌門(mén)（Proteobacteria） 則在固相上的相對(duì)豐度增加。Sun 等［20］研究認(rèn)為無(wú)論接種物來(lái)自于反應(yīng)器還是活性污泥，纖維素或稻秸發(fā)酵體系中，F(xiàn)irmicutes 都占主導(dǎo)地位。其中梭菌目（Clostridiales） 中的種屬，如梭菌屬（Clostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、毛螺菌屬（Lachnospira）、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）等，能在秸稈降解中發(fā)揮重要作用［21］。Synergistetes 能和嗜乙酸型甲烷菌形成互營(yíng)菌群［22］，牛糞菌系接種體系中該門(mén)菌屬相對(duì)豐度的提高表明了互營(yíng)氧化作用的強(qiáng)化。Thermotogae 能利用碳水化合物產(chǎn)VFAs［23］，有利于發(fā)酵活性的提高。Spirochaetes中的螺旋體目（Spirochaetales） 則與水解木質(zhì)纖維素、發(fā)酵產(chǎn)酸活性的增強(qiáng)有關(guān)［19］。液相中Bacteroidetes 菌屬，如擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella） 的出現(xiàn)既參與秸稈水解又能發(fā)酵產(chǎn)酸［24-25］，從而提高了發(fā)酵代謝活性。而WWE1首先在處理活性污泥的厭氧反應(yīng)器中被發(fā)現(xiàn)，能利用發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)酸［26］，在對(duì)照體系中相對(duì)豐度的提高與VFAs 積累緊密相關(guān)。固相中相對(duì)豐度提高的菌群中，Chloroflexi 主要是碳水化合物的降解菌［27］。Proteobacteria 如互營(yíng)桿菌屬（Syntrophobacter）、消化腸狀菌屬（Pelotomaculum） 等，常出現(xiàn)在活性污泥降解體系中，在互營(yíng)氧化過(guò)程中發(fā)揮作用［11］。固液相菌群結(jié)構(gòu)的分析有利于揭示厭氧發(fā)酵體系的強(qiáng)化機(jī)制［6］。

圖4 發(fā)酵結(jié)束后細(xì)菌結(jié)構(gòu)在門(mén)水平上相對(duì)豐度的變化

3.5 功能種屬分析

3.5.1 固相功能菌群

固相中來(lái)源于接種污泥及牛糞菌系特定功能微生物的變化如表2 所示，Clostridium 是體系中的主要水解菌，對(duì)照體系豐度的升高易導(dǎo)致VFAs 的積累［5］。來(lái)源于牛糞菌系的高效纖維素水解菌瘤胃球菌（Ruminococcus）、纖維桿菌（Fibrobacter）在體系中的相對(duì)豐度高于對(duì)照，這也解釋了牛糞菌系接種后稻秸纖維素水解酶酶活及降解率顯著提高的現(xiàn)象。Chapleur 等［28］在纖維素的降解中，添加瘤胃液和市政廢棄物污泥共發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)瘤胃水解菌從體系中消失，研究者歸因于無(wú)法與污泥中功能菌競(jìng)爭(zhēng)，這與本研究所得結(jié)論不一致。Lutispora 及沉積桿菌屬（Sedimentibacter） 等屬于多糖降解產(chǎn)乙酸菌［19，29］，在牛糞添加體系中相對(duì)豐度的提高表明產(chǎn)乙酸代謝途徑得到強(qiáng)化，提高了產(chǎn)甲烷效率。如Deng 等［14］在研究稻秸和瘤胃內(nèi)含物共發(fā)酵時(shí)，發(fā)現(xiàn)固相上這兩類(lèi)菌屬的含量提高，與產(chǎn)甲烷活性增強(qiáng)密切相關(guān)。

一些來(lái)源于污泥的部分菌屬在牛糞菌系接種體系中含量降低或消失。如在沼氣反應(yīng)器中能降解各種多糖物質(zhì)的Bacteroides［24］，毛螺菌科（Lachnospiraceae） 中可溶性多糖降解菌Lachnospira［30］，該類(lèi)菌群的變化被認(rèn)為與稻秸降解中不同水解微生物存在競(jìng)爭(zhēng)有關(guān)［29］。

如表2 所示，牛糞菌系接種體系中甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina） 是主要類(lèi)型，這和牛糞菌系接種中乙酸的積累有關(guān)。來(lái)源于牛糞的甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter） 在發(fā)酵結(jié)束后相對(duì)豐度升高，達(dá)到了0.009 5%；而對(duì)照體系甲烷菌類(lèi)型中鬃毛甲烷菌（Methanosaeta） 的相對(duì)豐度最高。在豬糞和稻草共發(fā)酵配比試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)豬糞含有的易降解成分易導(dǎo)致VFAs 積累，降低了Methanobrevibacter 的相對(duì)豐度［2］，與本研究甲烷菌的變化不一致。在青貯牧草降解試驗(yàn)中，Methanosarcina 被發(fā)現(xiàn)位于固渣表面，研究者認(rèn)為由于纖維素水解產(chǎn)生的乙酸在固相上來(lái)不及擴(kuò)散，乙酸濃度的升高增強(qiáng)了Methanosarcina 的附著生長(zhǎng)［18］。在稻秸厭氧發(fā)酵試驗(yàn)中，通過(guò)殘?jiān)⑸镄螒B(tài)和功能菌群分析發(fā)現(xiàn)水解菌和Methanosarcina共存在固相上時(shí)，水解效率大大提高［14］。李?yuàn)W等［8］在豬糞與稻秸共發(fā)酵試驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵結(jié)束后Methanosarcina 相對(duì)豐度顯著提高。這也從甲烷菌類(lèi)型上解釋了牛糞菌系接種體系中嗜乙酸產(chǎn)甲烷代謝強(qiáng)化的現(xiàn)象。在豬糞與玉米秸稈共發(fā)酵試驗(yàn)中，Methanosarcina 占優(yōu)勢(shì)地位，但隨著有機(jī)負(fù)荷升高，嗜氫型Methanobrevibacter 相對(duì)豐度有所提高，并獲得高的甲烷產(chǎn)率［6］，與本研究甲烷菌結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致。研究表明，牛糞中存在的水解菌Ruminococcus、Fibrobacter 和 嗜 氫 型Methanobrevibacter 存在種間氫傳遞，當(dāng)體系產(chǎn)生的氫被Methanobrevibacter 利用后，能夠?qū)崿F(xiàn)氧化型NAD+載體的重生，水解和產(chǎn)甲烷活性都得到提高［21］。如在柳枝稷發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)Methanobrevibacter對(duì)纖維素結(jié)構(gòu)的水解起了重要作用［31］。而另一方面，嗜氫型甲烷菌活性如果受到抑制，會(huì)使水解微生物含量下降。如添加抑制產(chǎn)甲烷活性的溴乙基磺酸鈉（BES），導(dǎo)致高效水解菌Ruminococcus 從小麥秸稈發(fā)酵體系中消失［32］。本研究中接種牛糞菌系提高了Methanobrevibacter 在體系中的相對(duì)豐度，有利于加快種間氫傳遞，使稻秸的纖維素水解和產(chǎn)甲烷活性都得到了提高。

表2 固相上特定功能細(xì)菌和甲烷菌屬相對(duì)豐度的變化 %

3.5.2 液相功能菌群

液相中丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）、密螺旋體菌屬（Treponema）、Prevotella 等屬于產(chǎn)酸微生物［19，21］，和纖維素水解菌存在協(xié)同作用。如半纖維素降解菌Butyrivibrio、Treponema 可以和Ruminococcus、Fibrobacter 共同結(jié)合在稻秸和苜蓿上，首先裂解結(jié)構(gòu)中的木聚糖成分，而后實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素結(jié)構(gòu)的降解［33］。Prevotella 種屬能參與半纖維素成分的降解，發(fā)酵后產(chǎn)生不同類(lèi)型的VFAs［25］。如表3 所示。降解產(chǎn)酸菌的出現(xiàn)也解釋了體系中木聚糖酶活性的提高。發(fā)酵結(jié)束后，對(duì)照體系中該類(lèi)產(chǎn)酸菌屬相對(duì)豐度較高，降解產(chǎn)生的丁酸、乳酸及琥珀酸積累，易導(dǎo)致體系酸化，反而抑制了產(chǎn)甲烷活性［17］。

來(lái)源于接種物的氧化菌能夠和伴生菌形成互營(yíng)氧化菌群，有利于降低VFAs 的濃度［11］。如表3所示，本研究中互營(yíng)桿菌（Syntrophobacter） 和丙酸氧化菌（Pelotomaculum） 等主要存在于對(duì)照體系中；而氨基桿菌屬（Aminobacterium）［22］及丁酸型互營(yíng)單胞菌屬（Syntrophomonas） 等在接種體系相對(duì)豐度較高，能通過(guò)互營(yíng)氧化作用降低丙酸和丁酸濃度。但在豬糞添加小麥秸稈發(fā)酵的研究中，發(fā)現(xiàn)液相中存在Pelotomaculum，與Methanosaeta 形成互營(yíng)菌群，增強(qiáng)了丙酸氧化效率［12］，與本研究接種體系液相中互營(yíng)菌類(lèi)型不一致。液相中菌屬的變化也進(jìn)一步表明了體系中嗜乙酸產(chǎn)甲烷途徑占主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，降低了丙酸和丁酸的積累。

表3 液相上功能菌相對(duì)豐度的變化 %

4 結(jié)論

1） 牛糞菌系接種稻秸發(fā)酵試驗(yàn)中，分別在第4 天和第38 天出現(xiàn)了產(chǎn)甲烷峰，稻秸甲烷產(chǎn)率（以VS計(jì)） 達(dá)269.32 mL/g，比對(duì)照體系提高了35%。稻秸的干基質(zhì)量降解率達(dá)41.79%，纖維素和半纖維素的降解率分別為53.97%、56.14%。纖維素酶和木聚糖酶活性均值分別為18.82、214.55 U/mL。

2） 發(fā)酵結(jié)束后，細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化明顯，固相上水解功能菌Ruminococcus、Fibrobacter 的相對(duì)豐度高于對(duì)照體系，產(chǎn)乙酸菌Lutispora、Sedimentibacter 相對(duì)豐度提高。Methanosarcina 是主要甲烷菌類(lèi)型，Methanobrevibacter 相對(duì)豐度升高。在液相中，Treponema、Prevotella 等產(chǎn)酸微生物主要存在于對(duì)照體系中。Aminobacterium 和Syntrophomonas 等互營(yíng)氧化菌在接種體系中相對(duì)豐度較高，而Syntrophobacter 和Pelotomaculum 是對(duì)照體系的主要類(lèi)型。