牛夢雨， 李鉉軍， 郭志軍

(延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133002)

近年來，真菌毒素對食品安全的污染日趨惡化，其中，有關(guān)黃曲霉毒素(Aflatoxin,AF)引起對農(nóng)產(chǎn)品、乳制品、肉制品等食品的污染事件屢見不鮮，對食品安全和人類健康造成嚴重的威脅，給社會經(jīng)濟造成巨大的損失。黃曲霉毒素是一種典型的真菌毒素，主要是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的化學結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素衍生化合物[1-2]。1993年，世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(gòu)(IARC)將黃曲霉毒素劃定為Ⅰ類致癌物，經(jīng)黃曲霉毒素感染的人或動物會使肝臟組織遭到破壞，嚴重時則可導(dǎo)致肝癌甚至死亡，具有致命性危害[3]。根據(jù)黃曲霉毒素的化學結(jié)構(gòu)和毒性差異，主要可分為B1、G1、G2、M1、M25種[4]。黃曲霉毒素分布廣泛，在花生、玉米、大米、大豆等農(nóng)作物及其制品中主要以 B1、G1、G2為主，乳及其制品中主要是以M1、M2為主[5]。其中毒性最強是AFB1，其毒性相當于氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，三聚氰胺的416倍，具有相當強的致畸、致癌、致突變作用[6]。目前，國內(nèi)外針對 AF的檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法[7]、氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9]、薄層色譜法[10]、膠體金免疫層析技術(shù)[11]等，以上這些方法的應(yīng)用由于受到檢測過程繁瑣、檢測儀器設(shè)備昂貴、且需要專門的操作人員等原因，在一定程度上限制了AF在實際檢測中的應(yīng)用。因此，建立高效便捷、成本低廉、適應(yīng)性強的AF檢測方法，在分析食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域尤為重要。自上個世紀80年代以來，生物傳感器由于靈敏度高、檢測限低等優(yōu)良性能在檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速，其中具有代表性的核酸適配體生物傳感器在真菌毒素檢測領(lǐng)域中發(fā)揮了重要作用，納米材料因具有較好的結(jié)構(gòu)性能在生物傳感器領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，從而改善生物傳感器檢測的靈敏度。該文對近幾年來核酸適配體結(jié)合納米材料構(gòu)建的比色、熒光、電化學、拉曼4種生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的應(yīng)用研究進行綜述。

1 核酸適配體

核酸適配體(Aptamer)，簡稱適配體，是指經(jīng)過一種新的體外篩選技術(shù)—指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化(SELEX)，在隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中獲得的能特異結(jié)合蛋白或其他小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸，可以是RNA也可以是DNA，長度一般為25～60個核苷酸[12-13]。適配體能通過芳香環(huán)、π-π堆積、范德華力和帶電基團之間的靜電相互作用形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，與靶分子特異性結(jié)合[14]。適配體具有親和力高、特異性強、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定、靶分子范圍廣、易化學合成、改造與標記等優(yōu)點，目前研究常被用作分子識別元件[15]。由于適配體是一段單鏈寡聚核苷酸，本身不具備識別能力，在適配體與靶分子物質(zhì)特異性結(jié)合過程中無法產(chǎn)生可檢測的物理化學信號，因此，需要將適配體經(jīng)篩選修飾或借助換能器，將核酸適配體的識別過程轉(zhuǎn)變?yōu)橐子谧R別檢測、可定量處理的信號[16]。

2 核酸適配體生物傳感器

生物傳感器(Biosensor)主要由生物識別單元(抗體，適體)、換能器(電極、光波導(dǎo)、懸臂)、信號轉(zhuǎn)換器和信號處理器4部分組成[17]。核酸適配體生物傳感器(Aptamer-based biosensors)是由適配體為生物識別原件，經(jīng)過篩選修飾與目標分析物產(chǎn)生特異性結(jié)合引起檢測信號變化，從而實現(xiàn)對目標分析物的檢測[18]。目前根據(jù)檢測信號的不同，可將核酸適配體生物傳感器主要分為比色適配體生物傳感器、熒光適配體生物傳感器和電化學適配體生物傳感器、拉曼信號(SERS)適配體生物傳感器、離子共振(SPR)適配體生物傳感器、電化學發(fā)光(ECL)免疫傳感器等[19-20]。近年來，核酸適配體生物傳感器已廣泛應(yīng)用于有機農(nóng)藥殘留[21]、重金屬檢測[22]、生物毒素等[23]領(lǐng)域之中。

3 納米材料的應(yīng)用現(xiàn)狀

納米級結(jié)構(gòu)的材料簡稱為納米材料(nanomaterials)，是指在1～100 nm尺度范圍內(nèi)，納米材料的尺度與性能可同時發(fā)生特異性變化。納米材料具有優(yōu)于其他材料的光學性質(zhì)、催化性質(zhì)及特殊的物理機械性質(zhì)等，在光學、電學、熱學、磁學、催化、傳感等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[24]。納米材料因其良好的生物兼容性、穩(wěn)定性、表面等離子共振等特性在適配體生物傳感器領(lǐng)域中具有標記或增強信號的作用，從而提高檢測結(jié)果的靈敏度[25]。如納米金、碳納米材料、磁性粒子、半導(dǎo)體量子點(QDs)、二氧化硅納米顆粒和雜化納米結(jié)構(gòu)都是生物傳感器領(lǐng)域常用的納米材料。其中，球形AuNPs由于其獨特的物理化學性質(zhì)，如制備和改性簡單、相容性好、優(yōu)異的光學性能和獨特的催化活性，在生物分析領(lǐng)域引起了特別的關(guān)注。良好的磁學性能的Fe3O4成本低且易于制備，是最為常用的磁性納米材料，除此之外，基于量子點等其他納米材料在構(gòu)建適配體生物傳感器方面發(fā)揮了重要作用[26]?，F(xiàn)如今，納米材料越來越多地應(yīng)用于靈敏度高、選擇性強、快速和經(jīng)濟有效的分析設(shè)備，如納米顆粒，納米管，納米線等已經(jīng)被創(chuàng)建用于生命科學和生物技術(shù)等新型分析領(lǐng)域之中[27]。

4 結(jié)合納米材料的適配體生物傳感器在黃曲霉毒素檢測中的研究進展

4.1 比色適配體生物傳感器

比色信號檢測技術(shù)是指利用通過對溶液的顏色深度的比較，從而確定待測組分的含量的一種檢測方法[28]。由于操作簡單、靈敏快速、用肉眼觀察就可以檢測等優(yōu)點，是檢測平臺最為常用的檢測方法之一。

Luan等[29]開發(fā)了一種無標記的比色信號適配體傳感器，利用未修飾的納米金(AuNPs)和AFB1適體發(fā)生可視性變化，檢測AFB1。當AFB1不存在時，基于單鏈DNA帶有正電荷的堿基與帶有負電荷的納米金表面產(chǎn)生靜電排斥作用，使適體吸附到AuNPs表面，在高濃度NaCl的誘導(dǎo)下，AuNPs仍保持穩(wěn)定。當加入AFB1后，形成了AFB1/適配體復(fù)合物并從AuNPs的表面釋放，導(dǎo)致AuNPs溶液在高濃度NaCl的作用下破壞其穩(wěn)定性，發(fā)生聚集。肉眼可以看出這一過程中溶液由酒紅色變?yōu)樗{紫色。通過UV-vis光譜儀測定得到線性響應(yīng)和確定該系統(tǒng)的檢測靈敏度分別為0.025～100 ng/mL和0.025 ng/mL。

楊子音[30]選擇納米銀(AgNPs)及其復(fù)合粒子(SiO2-AgNPs)2種體系，并結(jié)合核酸適配體對AFB1進行可視化檢測。其原理為AgNPs在高濃度NaCl的誘導(dǎo)下易發(fā)生團聚現(xiàn)象，溶液會發(fā)生顏色變化。在AFB1不存在的情況下，適配體由于靜電作用吸附到AgNPs表面，AgNPs保持穩(wěn)定無團聚現(xiàn)象，溶液顏色為黃色。AFB1存在時，由于適配體與AFB1特異性結(jié)合并脫離AgNPs表面，AgNPs在NaCl的誘導(dǎo)下發(fā)生聚集，溶液顏色變?yōu)樽丶t色。納米銀(AgNPs)及其復(fù)合粒子(SiO2-AgNPs)2種體系所得到的檢測限分別為11.761和10.984 ng/L。

4.2 熒光適配體生物傳感器

基于熒光的適體傳感器主要分為無標記和帶標記2類。無標記適體傳感器不需要任何類型的生色團或熒光團，帶標記得適配體傳感器則至少需要一種形式的發(fā)色團或熒光團。常見的標記材料如：金納米粒子(AuNPs)、量子點(QDs)、氧化石墨烯(GO)等廣泛應(yīng)用于適配體傳感器的構(gòu)建[31]。

wei等[32]以金納米球(AuNSs)作為熒光猝滅材料，建立出一種簡單、靈敏的AFB1檢測方法。其以羧基熒光素(FAM)標記的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)(HP)的AFB1適配體互補鏈作為信號探針，根據(jù)適配體互補鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的開放性和封閉性，可用于構(gòu)建熒光傳感器。檢測原理為：當FAM標記的HP與AFB1適配體雜交，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開，形成雙鏈DNA，當雙鏈DNA在被Bio-SA修飾的AuNSs表面與其特異性結(jié)合時，F(xiàn)AM遠離AuNSs，導(dǎo)致猝滅效率降低，熒光強度增強。當AFB1存在時，AFB1優(yōu)先與適配體結(jié)合，雙鏈DNA裂解，標記FAM的HP恢復(fù)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使FAM接近AuNSs，發(fā)生熒光猝滅，熒光強度降低。熒光強度的變化用于檢測AFB1的添加量，在0.1～10 ng/mL的檢測范圍內(nèi)得到最低檢測0.021 3 ng/mL，并將已知濃度的AFB1加入玉米樣品中得到92%～112%的回收率。

Hongxia Tan等[33]基于介孔二氧化硅納米粒子(MSN)，設(shè)計一種新穎、簡單且無標簽的適體生物傳感器用于檢測AFB1。選擇MSN-NH2作為控制釋放系統(tǒng)的載體，將熒光指示劑(Rh6G)作為釋放信號探針加載到粒子內(nèi)部。作為“門控分子”和分子識別探針且?guī)ж撾姾蛇m配體與帶正電荷的MSN-NH2相互作用，將適配體固定在MSN-NH2粒子表面。適體傳感器(適體修飾的MSN-NH2裝有Rh6G的抗體)以檢測目標AFB1。在AFB1存在下，適配體與AFB1之間的特異性結(jié)合，適配體可以從MSN-NH2中脫附，從而打開“門”，釋放信號探針(Rh6G)。AFB1的濃度和AFB1的定量檢測最終可以通過熒光強度的改變來實現(xiàn)。測定結(jié)果表明，當AFB1濃度為0.5～50 ng/mL時，熒光強度線性增加，檢測限低至0.13 ng/mL。

郭婷等[34]通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，利用磁性納米材料的熒光猝滅能力和磁性分離技術(shù)，構(gòu)建了基于磁性納米材料(Fe3O4)的熒光適配體生物傳感器，用于檢測牛奶中AFM1。當體系中AFM1不存在時，在靜電作用下，標記羧基熒光素(FAM)的適配體吸附在Fe3O4磁性納米顆粒表面，通過能量共振轉(zhuǎn)移導(dǎo)致熒光猝滅；當體系中存在AFM1時，適配體與AFM1特異性結(jié)合并形成折疊結(jié)構(gòu)，適配體從Fe3O4磁性納米顆粒表面脫附，使熒光信號恢復(fù)，從而實現(xiàn)對FAM1的定量檢測。在0.05～0.70 μg/L線性范圍內(nèi)，檢測限為0.02 μg/L。檢測牛奶中AFM1的回收率為82.5%～102.3%。

Lu Z等[35]利用由CdTe/GO/QDs組成的猝滅體系，通過將AFB1的特定硫醇化適體連接到量子點(QDs)表面上，形成QDs-適配體復(fù)合結(jié)構(gòu)，GO納米片通過π-π共軛吸附QDs-適配體，導(dǎo)致QDs熒光信號猝滅。加入AFB1后，AFB1與QDs-適配體特異性結(jié)合，占據(jù)π-堆積相互作用的空間，使QDs的熒光得以恢復(fù)，根據(jù)QDs的熒光回收率反映AFB1的濃度。該方法得到的檢測限為0.312 ng/mL。

4.3 電化學適配體生物傳感器

電化學適配體傳感器是將適體分子識別和電化學信號相結(jié)合，把生物識別信號轉(zhuǎn)化為電信號，通過監(jiān)控電流、點位或電阻的變化來檢測目標分子。

王春燕等[36]利用“信號關(guān)閉”原理設(shè)計了一種電化學適配體生物傳感器，實現(xiàn)了對AFB1的檢測。其利用對苯二甲酸銅(Cu-TPA)中Cu(Ⅱ)可以產(chǎn)生強的電化學信號，并通過將金納米顆粒(AuNPs)負載到Cu-TPA上形成Cu-TPA/AuNPs復(fù)合結(jié)構(gòu)，進一步與DNA1(S1) 結(jié)合形成Cu-TPA/AuNPs/S1信號探針，再將Cu-TPA/AuNPs/S1分散液滴加到S3/S2/GE電極表面，形成Cu-TPA/AuNPs/S1/S3/S2/GE電化學傳感器，來進行電化學檢測。當加入一定量的AFB1后，使AFB1和S3相互作用，Cu-TPA/AuNPs/S1信號探針從電極表面脫落，差分脈沖伏安(DPV)信號降低，隨著AFB1濃度的增加，在10-5～10 ng/mL范圍內(nèi)氧化峰電流(I)與AFB1濃度的對數(shù)(lgc) 呈反比，測得的檢測限為4.2×10-6ng/mL(S/N=3)，且具有良好的重現(xiàn)性，利用該核酸適配體生物傳感器檢測啤酒中的AFB1得到95%～106%的回收率。

Sondes Ben Aissa等[37]基于二茂鐵和硅納米粒子(SiNPs)的設(shè)計了一種新型適配體傳感器用于檢測牛奶中的AFM1。鑒于硅納米材料可增加電容功率的半導(dǎo)電特性，并通過電化學阻抗譜法(EIS)測量表面束縛二茂鐵膜的氧化還原電容信號的變化，開發(fā)了一種基于電化學電容譜(ECS)的新型電容轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。首先，采用聚對苯二胺(PpPD)/硅納米復(fù)合材料對碳表面進行功能化，放大背景電容信號。然后二茂鐵二酸(作為碳表面與適配體連接劑)通過碳二亞胺交聯(lián)反應(yīng)與胺端配體共價結(jié)合，第2個游離羧基通過酰胺化固定AFM1適配體。當AFM1存在時，適配體與AFM1共價偶聯(lián)后形成G-四鏈體折疊結(jié)構(gòu)，通過在生物識別層中適配體負電荷的重新分配，此時，形成的適配體/AFM1復(fù)合物改變了帶正電荷的二茂鐵作為氧化還原探針的狀態(tài)密度，從而導(dǎo)致氧化還原電容值的降低，ECS信號下降。測得最低檢測限為1.48 pg/L。

4.4拉曼信號(SERS)適配體生物傳感器

利用拉曼檢測信號的適配體生物傳感器具有靈敏性高，特異性強、檢測快速高效等優(yōu)點。蒲洪杉等[38]采用SH-cDNA修飾的Fe3O4@Au納米花(Fe3O4@AuNFs)作為捕獲探針，將SH-Apt修飾的Au@Ag納米球(Au-4MBA@AgNSs)作為信號探針建立了一種新型SERS適配體傳感器檢測AFB1。AFB1適體及其互補鏈的識別橋接了捕獲探針和信號探針之間的聯(lián)系，然后產(chǎn)生了4-巰基苯甲酸(4-MBA)的強SERS信號。隨著適配體與AFB1的優(yōu)先結(jié)合，信號探針從捕獲探針中釋放，從而導(dǎo)致SERS強度線性降低。根據(jù)SERS強度的改變，檢測AFB1的濃度，在0.000 1～100 ng/mL的線性范圍內(nèi)，測得的檢測限為0.40 pg/mL。此外，在花生油樣品中獲得96.6%～115%的回收率。

Quansheng Chen等[39]基于氨基酸末端適配體共軛磁珠(CS-Fe3O4)、AuNR@DNTB@Ag納米棒(ADANRs)及氨基末端的AFB1適配體(NH2-DNA1)，設(shè)計了一種新型的拉曼信號適配體生物傳感器技術(shù)，提高了AFB1檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。其主要分別用NH2-DNA1-CS-Fe3O4和SH-DNA2-ADANRs作為富集納米探針和報告納米探針，將(二硫代二硝基苯甲酸)DNTB嵌入金、銀核/殼納米棒中，因其具有較大的拉曼散射截面且無熒光干擾，從而提高了拉曼信號的穩(wěn)定性。當AFB1不存在時，CS-Fe3O4與ADANRs及適配體形成復(fù)合物，保持拉曼信號的穩(wěn)定性，當AFB1存在時，由于AFB1與NH2-DNA1-CS-Fe3O4競爭性結(jié)合，誘導(dǎo)SH-DNA2-ADANRs與CS-Fe3O4解離，拉曼信號強度降低，根據(jù)拉曼信號的強度變化檢測AFB1的濃度，在0.01～100 ng/mL線性范圍內(nèi)，檢測限為0.003 6 ng/mL，相關(guān)系數(shù)為0.986。

Xiuming Yang等[40]利用納米晶體(GDADNTs)作為傳導(dǎo)納米探針，氨基酸末端適配體綴合磁珠(CS-Fe3O4)作為捕獲納米探針，開發(fā)了一種具有較高活性和穩(wěn)定性的拉曼信號適配體生物傳感器AFB1檢測平臺。在檢測過程中，傳導(dǎo)納米探針、捕獲納米探針與適配體結(jié)合，分別形成傳導(dǎo)納米粒子(GDADNTs-Apt)與捕獲納米粒子(CS-Fe3O4-Apt)復(fù)合結(jié)構(gòu)，當AFB1不存在時，GDADNTs-Apt與CS-Fe3O4-Apt不會產(chǎn)生聚集現(xiàn)象，經(jīng)磁分離后無拉曼信號產(chǎn)生，當AFB1存在時，GDADNTs-Apt、CS-Fe3O4-Apt與AFB1會通過適配體特異性結(jié)合聚集在一起，形成(GDADNTs-Apt-AFB1-Apt-CS-Fe3O4)檢測平臺，經(jīng)磁分離后析出物中有拉曼信號產(chǎn)生，根據(jù)不同濃度AFB1中SERS強度的不同，達到高靈敏度定量檢測的目的，在0.001～10 ng/mL線性范圍內(nèi)，其檢測限為0.54 pg/mL。

對于黃曲霉毒素的檢測，以上4種基于納米材料的適配體生物傳感器的相關(guān)報道較多，除此之外，還有表面等離子共振(SPR)適配體生物傳感器、電化學發(fā)光(ECL)免疫傳感器等，但這幾種生物傳感器開發(fā)難度大、穩(wěn)定性差且成本較高，所以基于納米材料的其他適配體生物傳感器在黃曲霉毒素檢測方面還有待于進一步研究。

5 展望

黃曲霉毒素由于其強烈的毒性與致癌性，嚴重影響食品質(zhì)量安全并且威脅著人們的身體健康，建立高效簡便的測定方法十分必要。適配體具有高靈敏度、高選擇性、低成本等優(yōu)點，促使適配體生物傳感器在分析研究領(lǐng)域備受青睞。納米材料的迅速發(fā)展，現(xiàn)已在醫(yī)療、農(nóng)業(yè)、食品等方面得到普遍應(yīng)用，也為基于納米材料的適配體生物傳感器創(chuàng)造了更為廣闊的發(fā)展空間。隨著目前檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，生物傳感器的性能也在不斷完善，相信基于納米材料的適配體生物傳感器在未來食品安全領(lǐng)域其他有害物質(zhì)檢測方面也將擁有更為廣闊的開發(fā)前景。