吳曉晗， 范明智， 李學(xué)峰， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

東北刺人參(OplopanaxselatusNakai)，又稱(chēng)刺參或刺人參，為五加科刺參屬多年生藥用植物，主要分布于吉林省長(zhǎng)白山區(qū)，俄羅斯、朝鮮也少有分布，是我國(guó)二級(jí)保護(hù)植物[1]。東北刺人參根較長(zhǎng)且粗大，耐寒，但懼怕陽(yáng)光直射，含有多種活性物質(zhì)，主要包括黃酮類(lèi)、總酚類(lèi)、蒽醌類(lèi)、多糖類(lèi)、皂苷類(lèi)、揮發(fā)油、不飽和脂肪酸和微量元素等[2-3]，具有抗真菌、抗氧化、預(yù)防腫瘤、抗衰老、鎮(zhèn)痛、解熱、補(bǔ)氣助陽(yáng)等功效[4-5]。

黃酮類(lèi)物質(zhì)作為植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物之一，可作為一種天然的抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，具有延緩衰老、防治疾病的作用[6]，其以純天然，高活性，見(jiàn)效快等優(yōu)點(diǎn)引起專(zhuān)家學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。目前，大量關(guān)于東北刺人參的藥理活性研究圍繞著黃酮類(lèi)物質(zhì)展開(kāi)。王廣樹(shù)等[8]試驗(yàn)從東北刺人參葉片中分離出黃酮苷，根據(jù)光譜測(cè)定結(jié)構(gòu)，確定了山萘黃素等黃酮類(lèi)化合物。陳紅梅等[9]研究結(jié)果表明，黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)清除自由基和抗氧化能力等的一類(lèi)物質(zhì)。曲淑巖等[10]通過(guò)用東北刺人參乙醇提取物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃試驗(yàn)，結(jié)果表明小鼠的耐缺氧能力提高體內(nèi)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)有抗衰老的效果，從而證明東北刺人參具有抗衰老作用。而近年調(diào)查表明，天然東北刺人參已經(jīng)寥寥無(wú)幾，野生資源極度短缺[11]。在東北刺人參稀缺的情況下，生物反應(yīng)器成為組培快繁的重要方式[12]，相比于其他培養(yǎng)方式而言，其具有生產(chǎn)成本較低，可周年生產(chǎn)，不受季節(jié)條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可為植物生長(zhǎng)和代謝提供良好的環(huán)境，從而得到更多的生物量和代謝產(chǎn)物。目前李慧娟[13]已建立東北刺人參不定根反應(yīng)器培養(yǎng)體系，而不定根總黃酮提取工藝的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此，該試驗(yàn)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根為試驗(yàn)材料，在不同的提取溶劑、時(shí)間、溫度、次數(shù)和料液比條件下，對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 進(jìn)行了四因素三水平正交試驗(yàn), 從而優(yōu)化東北刺人參不定根總黃酮的提取工藝。由于黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化作用, 因此在東北刺人參不定根總黃酮的最佳提取工藝條件下采用DPPH、ABTS和鐵離子螯合力等3種方法評(píng)價(jià)了在最佳條件下東北刺人參不定根提取物的抗氧化活性，旨在為東北刺人參不定根應(yīng)用于化妝品相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照于丹[14]的試驗(yàn)方法，對(duì)東北刺人參不定根進(jìn)行增殖。將增殖培養(yǎng)后的不定根切成約1 cm小段，稱(chēng)取不定根20 g(鮮重)將其接種于氣球型氣升式生物反應(yīng)器內(nèi)。培養(yǎng)基為MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L，pH值5.8。將反應(yīng)器的通氣量設(shè)置為75 mL/min，在25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，45 d后收獲。將收獲的不定根用水沖洗3次，瀝干后放入烘干箱中進(jìn)行干燥，烘干后的不定根干品即為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 不定根提取溶劑的篩選

精密稱(chēng)取東北刺人參不定根干品1 g，放置在燒瓶?jī)?nèi)，分別加入乙醇、甲醇、水，利用超聲提取法，在50 ℃和40 kHz的頻率下提取1 h后過(guò)濾。重復(fù)2次后合并濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液進(jìn)行減壓濃縮至膏狀物，將濃縮的膏狀物置于45 ℃的烘干箱中干燥直至恒重后進(jìn)行總黃酮含量的測(cè)定。

1.2.2 不定根提取濃度的篩選

將東北刺人參不定根干品1 g浸泡在乙醇中,研究在不同乙醇濃度條件下東北刺人參不定根提取物對(duì)總黃酮含量的影響。按照1.2.1方法制備提取物,將乙醇濃度設(shè)置為25%、50%、75%和100%,測(cè)定不同濃度的提取物對(duì)總黃酮含量的影響,確定提取溶劑的最佳濃度。

1.2.3 不定根提取時(shí)間、次數(shù)、溫度以及料液比的篩選

將不定根干品1 g置于50%的乙醇中，研究在不同提取時(shí)間、溫度、次數(shù)以及料液比的條件下，提取工藝對(duì)不定根中總黃酮含量的影響。按照1.2.1方法提取不定根提取物，通過(guò)測(cè)定總黃酮含量，依次確定最適宜的提取工藝條件。

1) 提取時(shí)間試驗(yàn)：將提取時(shí)間設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h, 在50℃，料液比為1∶30 (g∶mL)的條件下，提取2次后對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，其他提取物提取方法同1.2.1；

2) 提取次數(shù)試驗(yàn)：以提取時(shí)間試驗(yàn)中不定根中黃酮含量最高的時(shí)間作為提取條件，將提取次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4、5次后對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，其他提取物制備方法同1.2.1；

3) 提取溫度試驗(yàn)：以提取次數(shù)試驗(yàn)中不定根中黃酮含量最高的次數(shù)作為提取條件，將提取溫度設(shè)置為30、50、70、90 ℃后對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，其他提取物制備方法同1.2.1；

4) 料液比試驗(yàn)：以提取溫度試驗(yàn)中不定根中總黃酮含量最高的溫度為提取條件，將料液比設(shè)置為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g∶mL)后對(duì)總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，其他提取物制備方法同1.2.1。

1.2.4 總黃酮提取工藝的優(yōu)化

參照上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選不同提取時(shí)間、溫度、次數(shù)以及料液比4個(gè)單因素，以東北刺人參不定根提取物中總黃酮的含量作為指標(biāo)，設(shè)定4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)(表1)，確定最佳的提取工藝。然后根據(jù)正交試驗(yàn)中最佳提取工藝的條件，對(duì)其進(jìn)行重復(fù)3次的驗(yàn)證試驗(yàn)，以此確定該條件是否具有穩(wěn)定性。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 總黃酮含量的測(cè)定方法

東北刺人參不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量的測(cè)定方法參照Chang[15]的方法并稍加改動(dòng)。精密稱(chēng)取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用75%乙醇溶液定容至250 mL配制成濃度為40 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液以及各樣品待測(cè)液1.0 mL于試管中定容至2.0 mL。向每根試管中加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，充分搖勻6 min，最后加入4%的NaOH溶液2.0 mL。用紫外分光光度計(jì)(UV1102紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司，中國(guó))在510 nm下測(cè)定吸光值OD，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算出待測(cè)樣品溶液濃度，總黃酮含量按下述公式計(jì)算。

總黃酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中,C為待測(cè)樣品溶液濃度;V為待測(cè)樣品溶液體積;D為稀釋倍數(shù);m為干品質(zhì)量

1.2.6 抗氧化活性的測(cè)定

1) 清除DPPH自由基活性測(cè)定 參照Noie[16]的方法對(duì)DPPH自由基清除能力進(jìn)行測(cè)定。精密稱(chēng)取40 mg的提取物定容至20 mL，樣品濃度為2.0 mg/mL，將上述溶液依次稀釋至濃度為0.012 5、0.025、0.05 、0.1、0.2、0.4 、0.6、0.8和1 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，將抗壞血酸(VC，Sigma公司，美國(guó))配置為等濃度溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。稱(chēng)取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，索萊寶公司，中國(guó))粉末0.003 9 g，用甲醇溶液定容至100 mL。向試管中加入2 mL待測(cè)樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，為待測(cè)樣品組?？瞻讓?duì)照組用2 mL甲醇代替待測(cè)樣品。避光靜置30 min后用紫外分光光度計(jì)在517 nm下測(cè)定吸光值OD，按照下述公式計(jì)算出DPPH自由基清除率。

式中，A空為空白對(duì)照組吸光值;A樣為待測(cè)樣品組吸光值。

2) 鐵離子螯合能力測(cè)定 參照Fu等[17]的方法稍作改進(jìn)，對(duì)東北刺人參不定根最佳提取溶液的鐵離子螯合能力進(jìn)行測(cè)定。稱(chēng)取100 mg的提取物溶于5 mL蒸餾水中，溶液濃度為20 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，將檸檬酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))配制成等濃度溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。按照表2準(zhǔn)確吸取待測(cè)樣品溶液、蒸餾水、FeCl2(sigma公司，美國(guó))溶液、菲洛嗪(sigma公司，美國(guó))溶液于96孔板中，于室溫中靜置10 min。用酶標(biāo)儀(iMark酶標(biāo)儀，Bio-Rad，美國(guó))在562 nm處測(cè)吸光值(OD)，并計(jì)算出鐵離子螯合能力。

式中，A樣為待測(cè)樣品組吸光值，A對(duì)為對(duì)照組吸光值;A空為空白組吸光值。

表2 反應(yīng)液的組成

3) 清除ABTS+自由基活性測(cè)定 參照Garzon等[18]的方法進(jìn)行ABTS+清除試驗(yàn)，用去離子水配置2.45 mmol/L過(guò)硫酸鉀(K2S2O8，麥克林公司，中國(guó))和7 mmol/L的2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索萊寶公司，中國(guó))混合溶液，室溫避光靜置16 h，配置成ABTS+儲(chǔ)備液。試驗(yàn)前用去離子水將ABTS+儲(chǔ)備液的吸光值稀釋至在734 nm下為(0.700±0.02)。稱(chēng)取50 mg的提取物，溶于5 mL去離子水中，溶液濃度為10 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10 mg/mL的待測(cè)樣品溶液，將VC配置成等濃度溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。待測(cè)樣品組取0.1 mL待測(cè)樣品溶液和3.9 mL ABTS+溶液于試管中。取0.1 mL待測(cè)樣品溶液和3.9 mL去離子水于試管中，而空白對(duì)照組向試管中加入0.1 mL甲醇溶液和3.9 mL ABTS+溶液。搖勻后靜置6 min，用紫外分光光度計(jì)于734 nm下測(cè)得吸光值，按照下述公示計(jì)算出ABTS+清除率。

式中，A樣為待測(cè)樣品組吸光值；A對(duì)為待測(cè)樣品對(duì)照組吸光值；A空為空白對(duì)照組吸光值。

1.2.7 軟件分析及數(shù)據(jù)整理

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對(duì)比，顯著水平為0.05，每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

分別對(duì)不同溶劑提取的東北刺人參不定根提取物中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定(圖1)。

圖1 不同提取溶劑對(duì)東北刺人參總黃酮含量的影響

不同溶劑間總黃酮含量存在顯著性差異，黃酮含量依次為乙醇>甲醇>水。當(dāng)提取溶劑為乙醇時(shí)，總黃酮的含量明顯高于其他2種溶劑，達(dá)到99.28 mg/g(圖1)。因此，將乙醇設(shè)置為該試驗(yàn)中東北刺人參不定根提取物的最佳提取溶劑。

2.2 不同提取濃度對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

在探究提取溶劑濃度對(duì)東北刺人參不定根總黃酮含量的影響時(shí)，將乙醇濃度范圍設(shè)置為25%～100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，東北刺人參不定根提取物總黃酮的含量達(dá)到最高，為101.12 mg/g(圖2)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用50%的乙醇作為東北刺人參不定根提取的最適濃度。

圖2 不同乙醇濃度對(duì)東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同提取時(shí)間對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

提取時(shí)間從0.5 h遞加到2 h的過(guò)程中，總黃酮含量持續(xù)升高，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為119.87 mg/g(圖3)，在2 h之后，總黃酮含量顯著降低。因此，適宜的提取時(shí)間確定為2 h。

2.3.2 不同提取溫度對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

當(dāng)提取溫度從30 ℃遞加至50 ℃時(shí)，總黃酮含量呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮含量高達(dá)124.53 mg/g(圖4)。但是當(dāng)提取溫度再次升高時(shí)，總黃酮含量開(kāi)始緩慢降低。因此，適宜的提取溫度確定為50 ℃。

圖3 不同提取時(shí)間對(duì)東北刺人參中總黃酮含量的影響

圖4 不同提取溫度對(duì)東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.3.3 不同提取次數(shù)對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

不同提取次數(shù)對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響列于圖5。

圖5 不同提取次數(shù)對(duì)東北刺人參中總黃酮含量的影響

當(dāng)提取次數(shù)從1次增加至2次時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為129.78 mg/g。在提取次數(shù)為3、4和5次時(shí)，總黃酮含量隨著提取次數(shù)的增加顯著下降(圖5)。因此，選擇的最佳提取次數(shù)為2次。

2.3.4 不同液料比對(duì)東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

在提取試驗(yàn)中，料液比是指提取物干重與溶劑體積之比。當(dāng)料液比從1∶20(g∶mL)增加到1∶30 (g∶mL)時(shí)，總黃酮含量大幅升高，達(dá)到99.57 mg/g(圖6)，但料液比超過(guò)1∶40(g∶mL)時(shí)，總黃酮含量依次降低。因此，適宜的料液比選定為1∶30(g∶mL)。

圖6 不同提取料液比對(duì)東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.4 提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定L9(34)正交試驗(yàn)方案，對(duì)提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)和料液比(D)4個(gè)因素進(jìn)行不同組合，探究這些組合對(duì)總黃酮含量的影響，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3中的第4組,提取時(shí)間為2 h、提取溫度為30 ℃、提取次數(shù)為2次、料液比為1∶40 (g∶mL)時(shí)，總黃酮含量最高，達(dá)到175.04 mg/g，高于其它組合。結(jié)果表明：R值由大到小依次為：料液比(D)>提取時(shí)間(A)>提取次數(shù)(C)>提取溫度(B)。其中，影響最大的是料液比，其次是提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度。分別計(jì)算出各因素水平對(duì)總黃酮含量的平均值K，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和提取次數(shù)(C)中K2值最大，料液比(D)中K3值最大，綜上所述，最適宜的工藝條件為A2B2C2D3，即提取時(shí)間為2 h、提取溫度為50 ℃、提取次數(shù)為2次、料液比為1∶30。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

為確定最優(yōu)的提取工藝是否具有穩(wěn)定性，對(duì)正交試驗(yàn)中得到最佳提取條件(A2B2C2D3)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總黃酮的平均含量為185.74 mg/g，高于正交試驗(yàn)中總黃酮的含量最高的第4組(175.04 mg/g)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值較小，為0.6%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 抗氧化活性研究

在篩選出東北刺人參不定根總黃酮的最佳提取工藝后，試驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)不定根提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究(圖7)。由圖7-A可知, DPPH自由基清除能力隨著提取物濃度升高而升高，在提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到了95.56%。而圖7-B表示的是不定根提取物對(duì)鐵離子螯和能力的影響，當(dāng)濃度為0～5 mg/mL時(shí)，鐵離子螯和能力與提取物濃度呈正相關(guān),在濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到最大值，為75.15%，顯著高于陽(yáng)性對(duì)照檸檬酸(60.12%)。從圖7-C中可以明顯看出，提取物清除ABTS自由基的能力，隨著提取物濃度的提高， ABTS+清除率始終呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，當(dāng)提取物濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，ABTS+清除率達(dá)到98.33%，稍低于陽(yáng)性對(duì)照VC(100%)。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，由于對(duì)東北刺人參的大量采集,導(dǎo)致其野生資源逐漸稀少,直接影響了東北刺人參的研究與利用。而通過(guò)生物反應(yīng)器可以大量培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織或器官,目前已應(yīng)用于金線(xiàn)蓮[19]、高山紅景天[20]等多種植物培養(yǎng)中。通過(guò)生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根具有抗炎、抗癌以及抗氧化等多種功效。其含有的黃酮類(lèi)化合物具有很好的抗氧化效果，可以清除體內(nèi)自由基，延緩衰老，減少癌癥的發(fā)生, 成為保健品和化妝品的研發(fā)熱點(diǎn)。

現(xiàn)如今,超聲提取法被廣泛應(yīng)用于植物總黃酮的提取。姜守剛等[21]研究了野火球的提取工藝，其最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度50%,超聲時(shí)間75 min,料液比1∶20 (g∶mL),超聲功率350 W。在上述條件下,野火球總黃酮提取率為1.686%。牛明娟等[22]對(duì)澤漆黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示:

A ：DPPH自由基自由基清除能力，B：Fe3+螯和能力，C:ABTS+自由基清除能力。

乙醇濃度60%,料液比1∶25(g∶mL),超聲時(shí)間1 h,并且測(cè)得黃酮的含量13.71 mg/g. 王飛等[23]對(duì)青扦針黃酮提取條件優(yōu)化后的結(jié)果顯示, 青扦針黃酮最佳的提取條件為超聲溫度64.88 ℃、時(shí)間49.46 min、超聲功率319.63 W；此條件下,總黃酮提取率為4.118 69%。

該試驗(yàn)為了篩選東北刺人參不定根總黃酮最佳提取條件，采用超聲提取法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃、提取2次、料液比1∶30 (g∶mL)條件下，總黃酮含量達(dá)到最高，為185.74 mg/g。在此條件下，試驗(yàn)利用體外抗氧化方法對(duì)東北刺人參不定根提取物的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明，東北刺人參具有較強(qiáng)的抗氧化活性，最佳條件下的不定根提取物對(duì)DPPH和ABTS均有清除能力，其中，對(duì)ABTS自由基清除率達(dá)到了98.33%。而隨著提取物濃度的升高，鐵離子螯和能力呈正相關(guān)，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，鐵離子螯和能力達(dá)到平穩(wěn)。綜上所述, 東北刺人參不定根可作為抗氧化劑的一種較好的原材料，該研究對(duì)東北刺人參資源的開(kāi)發(fā)及利用提供了良好的理論基礎(chǔ)。