洪洋，楊開明

大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000

糖尿病可分為1型糖尿病(T1D)和2型糖尿病(T2D)。T1D是自身免疫炎癥介導的細胞凋亡導致胰島β細胞丟失，最終導致胰島素分泌減少。T2D是外周組織胰島素抵抗可導致胰島β細胞衰竭，進一步造成血糖升高。長期高血糖可導致糖尿病患者出現(xiàn)冠心病、腎病等并發(fā)癥，嚴重危害患者身心健康。傳統(tǒng)治療方法治療糖尿病效果不佳。Shapiro等[3，4]研究發(fā)現(xiàn)，胰島移植治療效果與胰島的分離純化率及存活率密切相關，且胰島移植僅對T1D患者治療效果較好。

胰腺內分泌細胞的發(fā)育過程，是由胰芽原始導管上皮干細胞分化為成熟的胰島功能細胞的過程，包括三個階段：第一階段是α細胞的形成；第二階段是β細胞的形成；第三階段為內分泌祖細胞繼續(xù)向胰島細胞分化，使胰腺具有外分泌與內分泌兩部分功能。有很多重要轉錄因子參與調控β細胞的分化與成熟[5,6]。目前胚胎發(fā)育中胰干細胞細胞譜系多樣化的分子調控機制仍不明確。轉錄因子的異位表達可改變或反分化體細胞的命運，這個過程被稱為細胞重編程。非β細胞重新編程為可產生胰島素的細胞可能為T1D患者的胰島β細胞再生治療提供新的思路和方法。研究[7]發(fā)現(xiàn)，胰十二指腸同源盒基因-1(Pdx-1)、神經生成素3(Ngn3)、V-maf肌腱膜化纖維肉瘤癌基因同源物A(Mafa)是三種關鍵的β細胞分化轉錄因子，可在胰腺發(fā)育的過程中相互影響，將不同類型的細胞轉分化為胰島素陽性細胞。Zhou等[8]研究也發(fā)現(xiàn)，這三種轉錄因子的特定組合可將成年小鼠中已分化的胰外分泌細胞重編程為形態(tài)、功能相似的β細胞，其與內源性胰島β細胞無本質區(qū)別，能分泌胰島素來改善高血糖癥。Pdx-1/Ngn3信號通路可促使β細胞分化，促進干細胞向β細胞分化和增殖，通過β細胞移植治療T1D及晚期T2D，具有較好的臨床應用前景?，F(xiàn)將有關Pdx-1/Ngn3信號通路在胰島β細胞分化中的作用機制研究進展綜述如下。

1 Pdx-1在胰島β細胞分化中的作用機制

β細胞特異性轉錄因子可調節(jié)胰島素的合成和分泌，這些轉錄因子不僅受其他基因的表達調節(jié)，而且還受其他蛋白質的活性和翻譯后修飾的調節(jié)。在胰腺內分泌部發(fā)育的調控信號網絡中，Pdx-1/Ngn3信號各轉錄因子及其蛋白對Ngn3的調控是該信號的關鍵，在胰腺早期發(fā)育中，Pdx-1表達于各種胰干細胞，其是胰島素轉錄因子也是同源域轉錄因子，是腺泡、導管和胰島細胞發(fā)育的重要因素，在胰腺外分泌和內分泌干細胞中均有表達[9,10]。

Pdx1又稱為胰島素啟動子因子-1(IPF-1)、胰島素上游因子-1(IUF-1)或葡萄糖敏感因子。研究[11]發(fā)現(xiàn)，短暫的高血糖可促進大鼠血清Pdx-1基因表達，而持續(xù)的高血糖則明顯抑制血清Pdx-1基因的表達。在胚胎發(fā)育早期，Pdx-1僅在E9.5和E12.5之間胰的原始導管的干細胞中表達[7,12]。Kodama等[13]研究發(fā)現(xiàn)，彈性蛋白酶Cre介導的Pdx-1失活，會導致胰發(fā)育過程中外分泌部細胞分化受損，彈性蛋白酶Cre介導的Pdx-1基因突變小鼠則表現(xiàn)出葡萄糖穩(wěn)態(tài)降低，胰島素分泌減少，可以看出 Pdx-1對胰的發(fā)育及胰各種細胞的分化有著重要作用，Pdx-1的消耗和減少會引起大鼠葡萄糖耐受不良?；蚴Щ钛芯縖14]證明了Pdx-1在胚胎發(fā)生過程中的關鍵作用，Pdx-1敲除的小鼠會出現(xiàn)胰發(fā)育不全、Bruner′s腺缺失和十二指腸乳頭畸形。研究[15,16]發(fā)現(xiàn)，敲除Pdx-1基因的小鼠、綿羊會出現(xiàn)胰發(fā)育和功能障礙，進一步證明Pdx-1在胰早期發(fā)育和β細胞分化成熟中的關鍵作用，Pdx-1是胰發(fā)育和胰島素基因轉錄的重要調控基因。

2 Ngn3在胰島β細胞分化中的作用機制

Ngn3是對胰島發(fā)育有重要影響的轉錄因子，Ngn3可始動內分泌祖細胞，使其分化為內分泌細胞。具有內分泌的胰島細胞均來自瞬時表達高水平Ngn3的胰干細胞，Ngn3活性的喪失幾乎消除了胰島內分泌細胞的分化。小鼠胚胎發(fā)育中Ngn3表達從E11.5到E15.5達到峰值，Ngn3基因缺失的小鼠不能產生任何內分泌細胞，也不能表達胰島素基因增強結合蛋白1(Islet1)、樁蛋白4(Pax4)、Pax6、神經細胞分化因子1(NeuroD1)等轉錄因子，而缺失 Pax6、NeuroD1、轉錄因子相關蛋白Nkx6.1 或Nkx2.2的胰組織中仍存在Ngn3基因的表達，提示Ngn3是最早表達的堿性螺旋環(huán)螺旋結構轉錄因子，它位于這些因子的上游，是內分泌細胞啟動分化時所必需的轉錄因子，在促進胰內胚層細胞向內分泌細胞分化又能維持成熟胰島細胞的功能[17]。在成熟胰島細胞中，過度表達Ngn3可增強糖尿病患者胰島內分泌功能。Ngn3作為內分泌干細胞標記，與Pdx-1基因聯(lián)合可誘導非β細胞轉分化為β樣細胞，若Ngn3、Pdx-1與唯一一種β細胞胰島素基因活化轉錄因子Mafa結合，其相互協(xié)同作用還可使多功能干細胞分化為胰島素分泌細胞，但其潛在風險尚需要深入研究。

Ngn3蛋白的磷酸化或調節(jié)轉錄因子的翻譯后修飾，能改變促進非β細胞向β細胞分化的微環(huán)境，提高β樣細胞的分化率[18]。進一步實驗[19]證明，去除生長因子對細胞周期的抑制可使Ngn3去磷酸化，促進β樣細胞表達胰島素基因，促進胰干細胞向內分泌細胞分化，表明抑制Ngn3的磷酸化可促進功能性β細胞的生成。Matsuoka等[20,21]發(fā)現(xiàn)，Mafa能增強Pdx-1將Ngn3陽性的內分泌干細胞重編程為胰島素陽性細胞、將定型的胰高血糖素α陽性細胞轉分化為正常陽性細胞的能力，同時Pdx-1和Mafa共同作用，促進α細胞轉分化為胰島β細胞，且單獨的Pdx-1基因表達無法在體內將α細胞轉化為胰島β細胞，進一步說明，糖尿病細胞治療時轉錄因子相互作用對 胰島β細胞分化和增殖的重要作用。因此，人體胃、腸組織上皮等導管類器官，可作為功能性胰島β細胞的可再生來源，在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展和治療的研究中發(fā)揮重要作用。

3 Pdx-1/Ngn3信號通路在胰島β細胞分化中的作用機制

在復雜的Ngn3轉錄調控網絡中，Notch信號通路可通過誘導Sox9表達來間接調控Pdx-1、Ngn3表達。Ngn 3基因啟動子可被 Notch信號下游靶基因Hes1 阻遏蛋白抑制表達。Pdx-1可通過結合其他轉錄因子間接或直接激活Ngn3的表達等多條信號通路，隨后的調控中，Ngn3又分別激活下游轉錄因子Islet1 、NeuroD1、胰島素瘤相關蛋白1(Insm1)、Insm2，最后調控胰島干細胞分化產生β細胞、α細胞、δ細胞、PP細胞和ε細胞等5種內分泌功能細胞[2,22,23]。

胰腺內分泌細胞亞型由轉錄因子的協(xié)同活性決定，這些由基因編碼的蛋白作用于胰干細胞，表明Ngn3與胰島各內分泌干細胞相互作用，與Ngn3下游基因表達構成的相關轉錄因子形成較復雜的調控網絡，通使胰島內分泌干細胞分化形成成熟的胰島細胞。從Pdx-1/Ngn3信號通路的調控作用來看，Pdx-1是Ngn3基因的上游調控因子，可通過激活Ngn3的表達調控胰干細胞分化。在胚胎發(fā)育過程中，位于Ngn3上游的基因在遺傳譜系追蹤發(fā)現(xiàn)，Pdx-1基因在胰島內分泌干細胞中可直接作用調節(jié) Ngn3 表達。

Pdx-1可控制胰腺的早期胚胎發(fā)育和產生胰島素的胰島β細胞的后期分化，在胰腺早期發(fā)育過程中參與交叉調節(jié)轉錄因子網絡來促進內分泌祖細胞的分化。Pdx-1突變的小鼠血清Ngn3以及性別決定區(qū) Y 框蛋白9(Sry related HMG box-9，Sox9)、肝細胞核因子6(Hnf6)、Hnf1b和叉頭框蛋白A2(Foxa2)等其他調節(jié)Ngn3基因表達的轉錄因子水平均降低[1,24]。而胰內分泌干細胞轉錄因子Insm2是Ngn3下游的直接靶基因，也是該信號通路的下游調控因子。在Pdx-1和Ngn3的協(xié)同作用下，調節(jié)Insm2的啟動子，激活其表達。Insm2再通過上調胰島干細胞分化的關鍵基因Pax6、Nkx2.2、Nkx6.1表達，從而進一步分化為各胰島干細胞，隨后再繼續(xù)分化為成熟的β細胞胰島β細胞。其中，Insm2基因受 NeuroD1和Ngn3調節(jié)，NeuroD1(編碼神經源性分化因子1)是參與內分泌細胞譜系以及神經元發(fā)育的基本環(huán)螺旋轉錄因子。Ngn3直接激活的NeuroD1參與成熟胰島細胞的維持和分化[25]。二者通過與Insm2 啟動子的近端E盒結合，促進神經內分泌組織中Insm2的表達[26]。

NeuroD1雜合子基因突變會導致年輕型晚期糖尿病(maturity onset diabetes of the young 6，MODY 6)[27]。目前MODY 6是臨床上異質性的單基因疾病，易感人群為青春期及<25歲的成年人，其特征是胰島β細胞功能障礙，確診時要與T1D和T2D鑒別診斷[28]。決定胰島內分泌細胞命運的Ngn3及其直接靶基因如Insm2、Pax6、Nkx2同源框2(Nkx2.2)、Nkx6.1(NK6 Homeobox 1)在胰組織各種細胞中均有表達，基因敲除Insm2以外的靶基因均可影響胰內分泌細胞的分化和形成[13]。

3.1 Insm2 Insm2與Insm1是從胰島細胞中分離出的兩個同源基因，并且編碼的蛋白有相似的蛋白結構。其在胰島細胞中的表達受轉錄因子Ngn3及其靶基因NeuroD1的調節(jié)。Insm2在胚胎胰發(fā)育的內分泌細胞中表達，小鼠胚胎從E11.5到E13.5或孕8～20 周時在胎兒胰組織中達到表達峰值，并與Ngn3表達存在重疊。Insm2表達在E11.5到E13.5時瞬時增強，并在Ngn3 / NeuroD1轉導的胰導管上皮細胞中被激活。

Cai等[29]使用瞬時轉染實驗以及染色質免疫沉淀(ChIP)技術分析了Insm2基因的5′上游區(qū)域，證明了Ngn3和NeuroD1是Insm2基因上游調控的激活因子。Wang等[30]采用CRISPR-Cas9方法制備純合Insm2-/-小鼠，Insm2-/-小鼠空腹血糖水平高于野生型，葡萄糖耐量和胰島素/ C肽水平均降低野生型。證明Insm2的缺失會減少葡萄糖刺激的胰島素分泌和降低葡萄糖耐量，Insm2-/-小鼠中Insm1、Ngn3和NeuroD1的轉錄水平增加，表明Insm2參與神經內分泌組織的發(fā)育途徑，該途徑受轉錄因子Ngn3、NeuroD1和Insm1調控。

3.2 Pax6 Pax6是胰島β細胞Insulin基因表達的直接激活劑，并維持成熟胰島β細胞的功能和特性。缺乏Pax6可導致進行性致死性糖尿病。在胰島β細胞中Pax6結合的基因在缺失后相應下調，這些被結合和調控的基因多半可在Pax6缺陷型胰島β細胞中被激活，表明Pax6在胰島β細胞中既起轉錄激活因子作用，又起阻遏作用，抑制Ngn3啟動子、Ngn3的轉錄調節(jié)子的表達，或者抑制Ngn3調節(jié)劑Foxa2可發(fā)揮其阻遏作用。

Pax6可通過調節(jié)胰高血糖素基因及Mafb、cMaf和NeuroD1/Beta2基因的轉錄影響α細胞的功能[31]。成年小鼠中若 Pax6 缺失會導致β細胞的大量喪失以及α細胞的擴增，最終出現(xiàn)低胰島素血癥和高血糖癥，α細胞出現(xiàn)的異?？赡苁铅录毎匦戮幊袒蛘吲苑置谧饔?，導致Pax6缺乏癥的獨特代謝表現(xiàn)，即嚴重的酮癥。Pax6還可直接結合并激活Pdx-1和Mafa基因啟動子，三者協(xié)同作用可激活參與β細胞分化和功能的必需基因。

3.3 Nkx2.2 Nkx2.2屬于哺乳動物NK2同源盒轉錄因子家族的成員，是胰和腸道神經內分泌分化的生物標記，是除σ細胞外所有胰島細胞都表達的細胞因子，也是參與ε細胞分化的關鍵性轉錄因子[32]。純合Nkx2.2無效突變的小鼠可患有糖尿病，可能原因為胰島β細胞的分化被移植，表明Nkx2.2在胰島β細胞的最終分化中發(fā)揮重要作用。ε細胞可調節(jié)胰島β細胞的各種功能。ε細胞能分泌生長素釋放肽，抑制胰島素從胰島β細胞的釋放，有助于升高血糖水平，同時參與胰島β細胞的生長和增殖，抑制胰島β細胞凋亡[33]。

Nkx2.2與NeuroD1間的遺傳相互作用可調控胰島PP細胞和ε細胞的相對比例。Nkx2.2阻止NeuroD1的激活可導致α細胞的形成，反之則導致β細胞形成[16]。Nkx2.2還可通過直接與胰島素啟動子結合、與胰島素基因激活復合物物理締合及誘導調節(jié)胰島素基因轉錄的其他蛋白質表達來發(fā)揮其功能。

3.4 Nkx6.1 Nkx2.2和 Nkx6.1都是α細胞命運決定因子Arx的直接轉錄阻遏物，Nkx2.2阻遏物活性的缺乏會導致小鼠β細胞向α細胞轉化，抑制Arx表達可穩(wěn)定β細胞的轉化[34]。Nkx6.1可在Ngn3 陽性細胞系中表達，但最后僅在胰島β細胞中持續(xù)表達。在β細胞分化前，Nkx6.1和Islet1通過直接轉錄機制拮抗內分泌前體中Arx的表達，阻止與Pdx-1協(xié)同合作的α細胞功能。此外，β細胞中Nkx6.1的失活，會導致β細胞同一性消失并轉化為δ細胞，使β細胞具有δ細胞的特性，在β細胞分化后，α細胞和PP細胞特異性基因的表達就會通過獨立于Nkx6.1的機制被抑制，表明Nkx6.1的特異性表達，是成熟β細胞的轉錄因子，能促進內分泌前體細胞向β細胞分化。

除了通過Arx抑制α細胞特異性基因外，Nkx6.1還可以將δ、PP和ε細胞的前體細胞重新分配在 β細胞譜系，誘導β細胞基因和抑制非β內分泌基因來促進 β細胞命運的選擇[35]。缺少Nkx6. 1會導致β細胞形成與分化異常,說明維持著β細胞的正常功能需要Nkx6. 1的持續(xù)表達。隨著β細胞分化，需要Nkx2.2來維持Nkx6.1的表達。在胰 β細胞形成中，Nkx6.1位于Nkx2.2的下游，介導了β細胞祖細胞的擴增和最終分化。可被Pax6基因激活表達[36]。

綜上所述，Pdx-1/Ngn3信號通路是調控胰島β細胞分化的重要信號通路。Pdx-1/Ngn3信號網絡各基因依次有序的表達調控，能將胰干細胞通過基因的順序編程分化為β細胞，隨后由控制成熟胰島細胞功能所需的轉錄因子網絡來控制。對于胰干細胞分化調控信號的研究，對臨床上糖尿病的生物治療策略具有重要價值。目前研究發(fā)現(xiàn)參與胰島細胞分化調控中的轉錄因子，能夠將胰其它內分泌細胞和外分泌細胞重新編程而分化為β細胞，證實了胰島β細胞的活性可通過胰組織其它細胞的可塑性而實現(xiàn)。全面認識胚胎胰發(fā)育以及胰島形成過程的調控機制，在探索糖尿病的治療尤其是細胞替代治療將具有創(chuàng)新意義。