郭茂，韓勇，徐陶，陳琰，李興元，孔德營 遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563000

殺蟲劑是農(nóng)藥的一個重要組成部分，目前常見的農(nóng)藥殺蟲劑主要有4大類，包括有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類。有機氯類目前應(yīng)用較少，主要包括滴滴涕、六六六和硫丹等；該類殺蟲劑結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，難以氧化和分解，具有高毒、高效、高殘留的特點，因而目前絕大部分國家已經(jīng)逐漸禁用該類殺蟲劑。但有機氯類殺蟲劑化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可長期殘留在土壤和生物體內(nèi)達(dá)數(shù)十年，因此有機氯農(nóng)藥的雄性生殖毒性仍是目前的研究熱點。有機磷類殺蟲劑具有經(jīng)濟、高效、殺蟲譜廣等特點，至今仍廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，該類殺蟲劑主要包括敵百蟲、敵敵畏、馬拉硫磷和毒死蜱等。擬除蟲菊酯類殺蟲劑具有高效、低毒、廣譜、擊倒快、殘留少等特點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭生活中，常用的有氰戊菊酯、氯氰菊酯和溴氰菊酯等。氨基甲酸酯類殺蟲劑除少數(shù)品種，如呋喃丹等毒性較高外，大多數(shù)屬中、低毒性，且殺蟲活效強、殺蟲譜廣，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，常用的有西維因、滅多威和呋喃丹等。隨著殺蟲劑使用的增加，人類接觸殺蟲劑的機會也愈來愈多，其引起的生殖健康危害也引起了世界各國學(xué)者的廣泛關(guān)注，越來越多的研究致力于揭示殺蟲劑的雄性生殖毒性的作用機制。本文將目前使用和研究較為廣泛的幾類農(nóng)藥殺蟲劑的雄性生殖毒性作用機制作一綜述。

1 干擾生殖內(nèi)分泌功能

雄性的精子發(fā)生主要受卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)介導(dǎo)的睪酮(T)調(diào)控，因此雄性體內(nèi)生殖激素T、FSH、LH水平對維持精子發(fā)生的微環(huán)境具有重要作用。此外，雌激素(E2)也是調(diào)控雄性生殖的重要因素，這主要與E2能夠刺激生精干細(xì)胞的增殖有關(guān)。研究顯示，多種農(nóng)藥殺蟲劑可干擾雄性的生殖內(nèi)分泌功能，影響其性激素水平，而導(dǎo)致生殖障礙[1,2]。

1.1 有機氯農(nóng)藥的生殖內(nèi)分泌干擾作用 研究表明，有機氯農(nóng)藥硫丹可通過影響雄激素合成相關(guān)的蛋白和酶，如類固醇激素合成急性調(diào)控蛋白(StAR)、細(xì)胞色素P450膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)、17β-羥化類固醇脫氫酶(17β-HSD)和3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-HSD)等的表達(dá)和活性來干擾T生成[1]。此外，Zhou等[3]發(fā)現(xiàn)，有機氯殺蟲劑可通過類固醇外源性受體(SXR)介導(dǎo)CYP3A和CYP7A1表達(dá)，干擾膽固醇和類固醇的代謝而影響類固醇激素水平。

1.2 有機磷農(nóng)藥的生殖內(nèi)分泌干擾作用 類似于有機氯農(nóng)藥，有機磷農(nóng)藥也具有干擾雄性激素合成相關(guān)酶和蛋白基因表達(dá)的作用[2]。進一步發(fā)現(xiàn)，有機磷農(nóng)藥毒死蜱是通過LH/LHR/PKA/CREB通路干擾雄性激素合成關(guān)鍵蛋白StAR表達(dá)[4]。同時，有機磷農(nóng)藥可影響下丘腦和垂體功能，干擾下丘腦促性腺激素釋放激素和垂體促性腺激素分泌，從而間接影響雄性激素水平[5]。此外，有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷還可降低睪丸中支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，而降低T水平[6]。

1.3 擬除蟲菊酯類殺蟲劑的生殖內(nèi)分泌干擾作用 擬除蟲菊酯類殺蟲劑也可通過下調(diào)T合成相關(guān)基因(如StAR、P450scc等)的表達(dá)而降低T水平。瞿建華[7]發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯類殺蟲劑氰戊菊酯抑制類固醇激素合成涉及cAMP/PKA信號通路和IGF信號通路，其機制可能是氰戊菊酯通過抑制cAMP的合成和干擾IGF1表達(dá)，繼而抑制StAR和P450scc基因表達(dá)。研究顯示，氰戊菊酯還可通過上調(diào)下丘腦-垂體-性腺軸中多個基因(如下丘腦GnRH1、垂體AR以及睪丸中AR、ERα等)表達(dá)和下調(diào)垂體ERβ mRNA表達(dá)，從而干擾性腺軸功能[8]。氯氰菊酯可通過激活L型Ca2+通道及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶活性，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子c-Fos、c-Jun、Egr-1表達(dá)，繼而上調(diào)垂體細(xì)胞LH、FSH和CgH基因的表達(dá)，最終促進LH、FSH分泌[9]。

1.4 氨基甲酸酯類殺蟲劑的生殖內(nèi)分泌干擾作用 Meng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，滅多威可通過影響雄性羅非魚下丘腦-垂體-性腺軸多個性激素相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)下丘腦GnRH2、GnRH3和垂體GnRHR、FSHβ mRNA表達(dá)，下調(diào)垂體LHβ、精巢AR、3-βHSD mRNA表達(dá)，而干擾雄性羅非魚的生殖內(nèi)分泌功能。岳晴晴[11]研究發(fā)現(xiàn)，呋喃丹可升高雄性斑馬魚機體E2含量，并上調(diào)肝臟及性腺雌激素受體(ERs)基因表達(dá)，誘導(dǎo)雄性斑馬魚產(chǎn)生卵黃蛋白原，導(dǎo)致其生殖功能損傷。

2 損傷生殖細(xì)胞遺傳物質(zhì)

精子由精原細(xì)胞經(jīng)分裂、增殖、分化、成熟而來。在精子發(fā)生過程中，若生精細(xì)胞的遺傳物質(zhì)受到外源性化學(xué)物質(zhì)干擾，精子的形態(tài)和功能將會受到影響，而這也必然會導(dǎo)致雄性生殖功能的損傷。

2.1 引起雄性生殖細(xì)胞DNA損傷 研究顯示，毒死蜱能夠嵌入DNA的螺旋雙鏈，與DNA分子的堿基作用形成嵌合物，使堿基化學(xué)結(jié)構(gòu)改變，進而造成DNA損傷[12]。有機磷農(nóng)藥還可使DNA色素酶A3的嵌入率、核魚精蛋白磷酸化水平和精子頭部磷酸化水平增加，而DNA色素酶A3可與魚精蛋白競爭性結(jié)合DNA；同時核魚精蛋白的磷酸化水平增加，使得魚精蛋白與DNA的結(jié)合減少，從而引起雄性生殖細(xì)胞染色質(zhì)固縮以及DNA結(jié)構(gòu)完整性的改變[13]。

2.2 引起染色體異常 農(nóng)藥殺蟲劑也可通過影響雄性生殖細(xì)胞染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)量而產(chǎn)生雄性生殖毒性。研究表明，有機氯農(nóng)藥可導(dǎo)致男性精子染色質(zhì)濃縮以及精液中含Y染色體的精子比例升高[14]。氰戊菊酯能夠增加男性染色體非整倍性頻率和染色體畸變數(shù)目，同時提升X、Y染色體和18號染色體二倍性頻率，使精子畸形率升高[15]。因此，農(nóng)藥殺蟲劑誘導(dǎo)的染色體異常也是其引起雄性生殖障礙的重要機制。

2.3 干擾F0代雄性生殖相關(guān)基因的甲基化水平 研究表明，有機氯農(nóng)藥雙對氯苯基三氯乙烷(DDT)的主要代謝產(chǎn)物p, p′-DDE可引起雄鼠精子細(xì)胞Igf2 DMR2基因低甲基化，使雄性仔鼠精子細(xì)胞印記基因H19表達(dá)上調(diào)、Igf2表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致子代雄性生殖功能損傷[16]。氰戊菊酯可通過干擾F0代精子基因組DNA功能基因CP17A1、NR5A1、PGRC1及生殖相關(guān)基因Ace、Foxo3a、Ptgfrn等的甲基化程度，從而影響F1代生殖激素水平及生殖相關(guān)指標(biāo)，對子代的生殖發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面作用[17]。

3 促進生殖細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡指由一系列基因激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用主導(dǎo)的，為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞自主有序的死亡。多種蛋白分子和凋亡途徑參與了細(xì)胞凋亡，其中主要的蛋白分子家族有4種：Caspase、Bcl-2、adapterproteins和IAPs，凋亡途徑主要有3種：死亡受體途徑、線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。在精子發(fā)生各個階段均存在自發(fā)性的生精細(xì)胞凋亡，但過度生殖細(xì)胞凋亡會阻礙精子發(fā)生，降低雄性生殖功能。

Guo等[18]發(fā)現(xiàn)，有機氯類殺蟲劑硫丹可通過上調(diào)小鼠精原細(xì)胞(GC-1spg細(xì)胞)p21cip1、p27kip1、p53基因表達(dá)，繼而啟動E2F-1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；同時還通過增加Fas/FasL表達(dá)，活化Caspase-8、Caspase-3，導(dǎo)致GC-1spg細(xì)胞凋亡。任南琪等[19]研究發(fā)現(xiàn)，硫丹還可能通過抑制Ca2+-Mg2+-ATPase和Na+-K+-ATPase的活性而升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡，從而誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡。此外，有機氯類殺蟲劑硫丹也可通過上調(diào)睪丸組織CytC表達(dá)和下調(diào)bcl-2表達(dá)來調(diào)控生精細(xì)胞凋亡[20]。有機磷類殺蟲劑的相關(guān)研究顯示，馬拉硫磷可通過影響凋亡調(diào)控蛋白bax、bcl-2表達(dá)，而促進大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡[21]。對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的研究顯示，氰戊菊酯可通過調(diào)控Caspase、Phlda1基因、bcl-2基因家族，而誘導(dǎo)雄性大鼠睪丸中生精細(xì)胞的凋亡[22,23]。氨基甲酸酯類殺蟲劑滅多威可上調(diào)JNK途徑中MAP3K、MKK4、JNK表達(dá)，增強轉(zhuǎn)錄因子AP-1的作用，促進p53、Bax等促凋亡蛋白表達(dá)，從而促使生殖細(xì)胞凋亡[24]。

4 誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)

在生殖系統(tǒng)各種器官組織中，活性氧(ROS)的產(chǎn)生是一種正常的生理現(xiàn)象，但若ROS生成過多，或者抗氧化酶活性降低，就會引起機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，進而損害生殖細(xì)胞，導(dǎo)致精子產(chǎn)生和成熟障礙。研究發(fā)現(xiàn)，p, p′-DDE可降低超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激，抑制雄鼠睪丸磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)，激活雄鼠睪丸內(nèi)生精細(xì)胞的線粒體凋亡途徑，阻礙正常精子發(fā)生[25]。Albasher等[26]發(fā)現(xiàn)，有機磷農(nóng)藥毒死蜱可通過下調(diào)Nrf2/ARE通路，而下調(diào)超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等的mRNA表達(dá)。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥氰戊菊酯可使雄鼠睪丸超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等活力下降，丙二醛含量升高，而導(dǎo)致雄鼠睪丸組織發(fā)生氧化損傷[27]。溴氰菊酯可通過降低雄性睪丸組織抗氧化酶活性、提高NOS活性，導(dǎo)致氧自由基、丙二醛、一氧化氮大量蓄積[28]。

5 干擾生殖系統(tǒng)相關(guān)酶的活性

雄性睪丸組織中存在多種與精子發(fā)生相關(guān)的酶，如酸性磷酸酶(ACP)、乳酸脫氫酶(LDH)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)等。研究發(fā)現(xiàn)，有機磷殺蟲劑馬拉硫磷可通過抑制睪丸組織LDH、γ-GT和ACP活性，繼而影響睪丸營養(yǎng)物質(zhì)的運輸、能量供給、T合成以及損傷支持細(xì)胞，最終影響精子發(fā)生，導(dǎo)致精子畸形率升高以及精子數(shù)量、活力降低[21]。此外，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥及氨基甲酸酯類農(nóng)藥均可通過影響睪丸組織標(biāo)志酶ACP、γ-GT、LDH活性，導(dǎo)致雄性生殖功能障礙[29,30]。

6 其他相關(guān)機制

除上述作用機制外，農(nóng)藥殺蟲劑還可以通過擾亂人和動物的生物鐘、干擾雄性生殖細(xì)胞的細(xì)胞周期以及干擾精子的頂體反應(yīng)等機制產(chǎn)生雄性生殖毒性。研究顯示，擬除蟲菊酯農(nóng)藥氰戊菊酯可通過干擾雄性大鼠生殖晝夜節(jié)律性而影響其生殖功能。沈歐璽[31]研究發(fā)現(xiàn)，氰戊菊酯可通過影響microRNA對時鐘基因Bmal1表達(dá)的調(diào)節(jié)，來干擾Bmal1基因下游的T代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)，從而表現(xiàn)出對T合成的晝夜時間毒性。路珊珊[32]研究認(rèn)為，氰戊菊酯可能通過升高Leydig細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，而影響時鐘基因Bmal1、REV-erbα、RORa等的表達(dá)和節(jié)律，并最終影響T分泌。

研究發(fā)現(xiàn)，硫丹通過抑制睪丸組織中Sohlh1、Cyclin A1、CDK1、CDK2表達(dá)，而引起生殖細(xì)胞周期阻滯，導(dǎo)致精子數(shù)目下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PKC-α信號途徑是介導(dǎo)硫丹干擾正常細(xì)胞周期的重要機制[33]。此外，農(nóng)藥殺蟲劑還可干擾精子的頂體反應(yīng)。研究顯示，氰戊菊酯能夠通過降低精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)流動性和抑制T型Ca2+通道電流，從而抑制精子的頂體反應(yīng)和受精能力[34]。

綜上所述，農(nóng)藥殺蟲劑對雄性生殖毒性的作用機制是多因素、多途徑的，并且各作用因素、作用途徑之間相互聯(lián)系、相互影響。關(guān)于農(nóng)藥殺蟲劑對雄性生殖毒性作用機制的研究，目前主要限于動物實驗，由于實驗動物生殖功能與人類并不完全相同，加之農(nóng)藥在動物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化及動物實驗暴露劑量、暴露途徑等與人類均有差異，致使動物實驗結(jié)果具有很大局限性。同時，隨著農(nóng)藥配伍使用和混配農(nóng)藥的大量生產(chǎn)和使用，往往使得接觸農(nóng)藥的人群體內(nèi)同時具有多種農(nóng)藥殘留，而目前就多種農(nóng)藥殘留對人類生殖健康影響的交互作用的研究還相對較少。因此，農(nóng)藥殺蟲劑對雄性產(chǎn)生生殖毒性的作用機制還有待進一步全面而深入的研究。