劉 雷,程靖華,石 迎,陶 潔,李本強(qiáng),劉惠莉*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106;2 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院,上海201306;3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海201106)

豬流感病毒(Swine influenza virus,SIV)NS1 蛋白對(duì)病毒的毒力發(fā)揮具有重要作用[1-2]。 NS1 蛋白全長(zhǎng)215—237 個(gè)氨基酸(Amino acid,aa),包括2 個(gè)功能區(qū):一個(gè)是N 末端1—73aa 的RNA 結(jié)合區(qū)(RNAbinding domain,RBD),其中第19—38 位aa 為核心序列,是雙鏈RNA(Double strand RNA,dsRNA)的識(shí)別序列,只有R38aa 是必需的,相鄰aa 也發(fā)揮部分作用;另一個(gè)是C 末端效應(yīng)結(jié)合區(qū)(Effector domain,ED),第134—161 位aa 是核心序列;N 末端和C 末端通過(guò)Loop 區(qū)連接[3]。 病毒在感染細(xì)胞期間,NS1 蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后被轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中,在感染后期形成致密的晶體樣包涵體積聚于核中[4]。 NS1 蛋白的主要作用是抑制宿主免疫應(yīng)答,尤其是對(duì)I 型干擾素(IFN-α∕β)產(chǎn)生的抑制及對(duì)干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的雙鏈RNA 依賴性蛋白激酶R(Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)和2’-5’A 合成酶(2’-5’oligoadenylate synthetase,OAS)抗病毒作用的抑制[5-6],以維持病毒感染力。

已有報(bào)道顯示,NS1 蛋白能夠通過(guò)序列中2 個(gè)核定位序列(NLS)和1 個(gè)核輸出序列(NES)影響NS1蛋白的生物學(xué)功能。 經(jīng)典的NLS1 位于保守的第34—41 位aa,NLS1 對(duì)NS1 蛋白結(jié)合RNA 活性以及蛋白質(zhì)二聚化具有重要作用,根據(jù)Melen 等[7]的報(bào)道,在一株H1N1 人流感病毒中(A∕WSN∕33),NS1 蛋白第35、38、41 位的氨基酸通過(guò)與宿主蛋白中核輸出蛋白α 的相互作用影響流感病毒的致病性。 Wang 等[8]也曾報(bào)道過(guò)在另一株H1N1 人流感病毒中(A∕Udorn∕72)中,NS1 蛋白的第38、41 位氨基酸對(duì)雙鏈RNA(dsRNA)的結(jié)合活性具有重要作用。 NES 位于保守的第138—147 位aa,NES 具有阻斷宿主mRNA 剪接、多聚腺苷酸化及核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能,根據(jù)Tynell 等[9]的報(bào)道,在H1N1 人流感病毒(A∕Udorn∕72)突變NS1 蛋白NES 中的氨基酸后,NS1 蛋白的定位發(fā)生改變,病毒的復(fù)制能力和NS1 拮抗干擾素的能力也受到影響。已有大量的研究證實(shí)這2 個(gè)保守區(qū)域?qū)Σ《镜闹虏⌒院偷鞍椎纳飳W(xué)功能具有重要作用,但關(guān)于豬流感病毒NS1 蛋白NLS1 和NES 的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)分離株為模板,利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)NLS1 和NES 氨基酸序列中保守氨基酸第36 位亮氨酸(Leucine,L)、第38 位精氨酸(Arginine,R)、第141 位亮氨酸、第144 位亮氨酸、第146 位亮氨酸用丙氨酸(Alanine,A)進(jìn)行替換,構(gòu)建5 個(gè)重組真核表達(dá)質(zhì)粒,檢測(cè)各突變蛋白在細(xì)胞中的分布及其對(duì)細(xì)胞因子水平的影響,以期深入了解NS1 的生物學(xué)功能及關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的作用。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體和細(xì)胞

SIV 分離株A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存,pCAGGS 載體、293T 和A549 細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和引物

質(zhì)粒DNA 小提試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、預(yù)染蛋白質(zhì)Marker(QIAGEN),T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶(NEB),Lipofectamine 2000、DAPI、DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清和Opti-MEM 低血清培養(yǎng)基(Invitrogen),Pyrobest DNA Polymeras、DL2000 DNA Marker(TaKaRa),FITC 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H +L)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。 其他化學(xué)試劑均為分析純。

根據(jù)A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)株NS1 序列,設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物和特異性擴(kuò)增引物,NS1 基因上下游引物分別添加EcoRⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)。 根據(jù)GenBank 中的序列,設(shè)計(jì)IFN-β、OAS-1 和β-actin基因的擴(kuò)增引物(表1),引物由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。

1.3 NS1 及點(diǎn)突變基因的擴(kuò)增與載體構(gòu)建

以A∕swine∕Shanghai∕3∕2014(H1N1)毒株為模板,通過(guò)PCR 擴(kuò)增NS1 基因并克隆至T 載體,篩選陽(yáng)性質(zhì)粒。 利用重疊延伸PCR 方法進(jìn)一步擴(kuò)增NS1 點(diǎn)突變基因,獲得NS1 點(diǎn)突變基因片段。 PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。 通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物,并將目的DNA 片段切膠回收。 NS1 片段回收產(chǎn)物和pCAGGS 真核表達(dá)載體利用EcoRⅠ和NheⅠ限制性內(nèi)切酶同時(shí)雙酶切,經(jīng)T4 連接酶連接,然后轉(zhuǎn)化至DH5α 細(xì)胞。運(yùn)用質(zhì)粒PCR 和雙酶切方法鑒定陽(yáng)性重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-NS1,并送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。

按照上述方法構(gòu)建點(diǎn)突變重組質(zhì)粒pCAGGS-NS1L36A、pCAGGS-NS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGSNS1L144A、pCAGGS-NS1L146A。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the experiment

1.4 NS1 蛋白的表達(dá)

利用質(zhì)粒DNA 小提試劑盒提取pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1L36A、pCAGGS-NS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGS-NS1L144A、pCAGGS-NS1L146A質(zhì)粒,測(cè)定質(zhì)粒濃度。 利用Lipofectamine 2000 將各重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)良好的HEK-293T 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h 后移除原培養(yǎng)液,隨后加入2 mL 無(wú)血清OPTI-MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。 轉(zhuǎn)染48 h 后裂解細(xì)胞,提取蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,通過(guò)半干法轉(zhuǎn)印至NC 膜上進(jìn)行Westernblot 檢測(cè)。 一抗為NS1 多抗血清,孵育1 h,二抗為HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG,孵育1 h,顯色液使用HRP-DAB。

1.5 NS1 蛋白的細(xì)胞定位

將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分別在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h 棄去細(xì)胞上清;PBS 洗滌細(xì)胞,加入80%丙酮(預(yù)冷)固定細(xì)胞20 min;PBS 洗滌3 次,3 min∕次,自然干燥;加入1%Triton 細(xì)胞通透液,作用25—30 min;PBS 洗滌3 次,5 min∕次;加入5%脫脂牛奶,37 ℃封閉45 min;PBS 洗滌3 次,5 min∕次;加入NS1 多抗,37 ℃孵育1 h;PBS 洗滌后,二抗加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠IgG(H+L),37 ℃孵育45 min;PBS 洗滌后加入1 μg∕mL DAPI 覆蓋細(xì)胞,室溫避光10 min;終止反應(yīng),在倒置熒光顯微鏡下觀察重組蛋白表達(dá)及分布。

1.6 細(xì)胞因子的檢測(cè)

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h 提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄。 熒光定量PCR擴(kuò)增IFN-β、OAS-1。

熒光定量PCR 數(shù)據(jù)采用2-ΔΔct方法計(jì)算,利用SPSS 21.0 軟件分析各組間細(xì)胞因子水平的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 NS1 點(diǎn)突變真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

利用重疊延伸PCR 方法,成功擴(kuò)增NS1 及NS1L36A、NS1R38A、NS1L141A、NS1L144A、NS1L146A點(diǎn)突變基因片段,大小均為693 bp 左右,與預(yù)期相符(圖1A)。 各片段運(yùn)用T4 連接酶連接到pCAGGS 載體,經(jīng)質(zhì)粒PCR和EcoRⅠ、NheⅠ雙酶切鑒定,獲得陽(yáng)性重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-NS1、pCAGGS-NS1L36A、pCAGGSNS1R38A、pCAGGS-NS1L141A、pCAGGS-NS1L144A、pCAGGS-NS1L146A,其酶切結(jié)果見(jiàn)圖1B。 測(cè)序驗(yàn)證表明,NS1蛋白序列中第36 位亮氨酸(L)、第38 位精氨酸(R)、第141 位亮氨酸(L)、第144 位亮氨酸(L)、第146 位亮氨酸(L)正確突變?yōu)楸彼?A)。

2.2 Western-blot 鑒定NS1 點(diǎn)突變蛋白的表達(dá)

將各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞24 h,利用蛋白印跡檢測(cè)法檢測(cè)NS1 蛋白在A549 細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖2)。 結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染NS1 及其點(diǎn)突變質(zhì)粒的細(xì)胞中能檢測(cè)到約26 ku 的目的條帶,與預(yù)期大小一致;空白細(xì)胞中和轉(zhuǎn)染pCAGGS 空質(zhì)粒的細(xì)胞中均未檢測(cè)到NS1蛋白的條帶,表明NS1 蛋白及其各突變體在A549 細(xì)胞中可以表達(dá)。

2.3 NS1 及其點(diǎn)突變蛋白在A549 細(xì)胞中的定位分析

將各質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞,利用間接免疫熒光分析NS1 及其點(diǎn)突變蛋白在細(xì)胞中的定位情況。結(jié)果表明:在轉(zhuǎn)染12 h、24 h、36 h 后,NS1、NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A均勻分布在A549 的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A突變體蛋白與野生型NS1 蛋白在細(xì)胞中的分布沒(méi)有差異;在轉(zhuǎn)染24 h 時(shí),NS1R38A在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布,在轉(zhuǎn)染36 h 時(shí),NS1R38A蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中很少。 而NS1L144A主要分布在細(xì)胞質(zhì)中,基本不分布于細(xì)胞核,說(shuō)明NS1 蛋白中第144 位氨基酸與蛋白定位密切相關(guān)(圖3)。

2.4 熒光定量PCR 檢測(cè)免疫細(xì)胞因子的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平

將NS1 及其各突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 細(xì)胞,然后利用Real-time PCR 檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)免疫細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平,以了解NS1 蛋白中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)對(duì)細(xì)胞抗病毒反應(yīng)的影響。 結(jié)果顯示:各NS1 突變體蛋白在A549 細(xì)胞中INF-β 和OAS-1 的轉(zhuǎn)錄水平相比于沒(méi)有突變的NS1 蛋白明顯上升,且在36 h 時(shí)IFN-β 和OAS-1 轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高,在24 h 時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄IFN-β 水平比12 h 時(shí)增加近3 倍,24 h 時(shí)細(xì)胞OAS-1 轉(zhuǎn)錄水平比12 h 時(shí)增加近100 倍,說(shuō)明細(xì)胞可以在短時(shí)間內(nèi)激活細(xì)胞抗病毒反應(yīng)。 值得注意的是,NS1R38A突變體蛋白誘導(dǎo)IFN-β 和OAS-1 的轉(zhuǎn)錄水平最高,NS1L144A突變體蛋白也可以誘導(dǎo)IFN-β 和OAS-1 處于較高的轉(zhuǎn)錄水平,提示它們對(duì)宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)抑制能力最弱(圖4—5)。

3 結(jié)論與討論

在病毒感染周期中,宿主細(xì)胞中的免疫細(xì)胞因子通過(guò)激活多條途徑抑制病毒復(fù)制和調(diào)控細(xì)胞凋亡,以減少病毒對(duì)宿主的損傷。 而流感病毒NS1 蛋白可以通過(guò)多種途徑來(lái)應(yīng)對(duì)這種抗病毒反應(yīng),包括抑制宿主干擾素產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、與宿主蛋白相互作用等方式,以抵抗宿主細(xì)胞產(chǎn)生的免疫反應(yīng)[10]。

據(jù)報(bào)道,在病毒感染的細(xì)胞中,NS1 蛋白主要定位于細(xì)胞核,但在感染后的晚期細(xì)胞質(zhì)中會(huì)發(fā)現(xiàn)很大比例的NS1 蛋白[11-14]。 病毒感染的細(xì)胞中NS1 蛋白的不同定位情況會(huì)影響宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn),NS1 蛋白在病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞核中主要與CPSF30、PAPBII 相互作用,抑制宿主細(xì)胞mRNA加工修飾;而在病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中主要與RIG-1、TRIM25 結(jié)合,抑制干擾素的產(chǎn)生[15]。 本研究以H1N1 亞型豬流感病毒A∕swine∕Shanghai∕3∕2014 為對(duì)象,在線預(yù)測(cè)了NS1 蛋白NLS 和NES 區(qū)域中影響先天免疫的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。 通過(guò)點(diǎn)突變構(gòu)建NS1 突變體真核表達(dá)質(zhì)粒,發(fā)現(xiàn)它們轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,出現(xiàn)了不同的定位情況。 NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A突變體蛋白和野生NS1 蛋白一樣,均同時(shí)定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中;而在轉(zhuǎn)染36 h 后,NS1R38A主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,細(xì)胞核中很少;在轉(zhuǎn)染12 h、24 h、36 h 后,NS1L144A蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,僅有少量表達(dá)于細(xì)胞核中。 隨著時(shí)間變化,各蛋白的定位情況沒(méi)有發(fā)生變化,提示H1N1 亞型豬流感病毒NS1 蛋白中第38 位氨基酸可能有助于蛋白由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸,第144 位氨基酸與細(xì)胞定位有著密切關(guān)系,可能影響宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)機(jī)制。

最初研究表明,NS1 的特征在于通過(guò)阻止病毒RNA 和模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor,PRR)的結(jié)合來(lái)拮抗Ⅰ型干擾素的應(yīng)答。 隨后證實(shí),一方面,NS1 蛋白可以抑制蛋白激酶R(Protein kinase RNA,PKR)和OAS 活化,以及IFN 轉(zhuǎn)錄和IFN 前mRNA 的加工,通過(guò)調(diào)控機(jī)體抗病毒應(yīng)答,從而間接增強(qiáng)病毒的致病力;另一方面,NS1 蛋白可提高病毒復(fù)制水平,增強(qiáng)病毒mRNA 的翻譯,以此直接增強(qiáng)流感病毒對(duì)抗宿主的抗病毒應(yīng)答能力。 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了NS1 點(diǎn)突變對(duì)A549 細(xì)胞中INF-β 和OAS-1 轉(zhuǎn)錄水平的影響,結(jié)果顯示:在轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞上調(diào)IFN-β 和OAS-1 的轉(zhuǎn)錄水平,且NS1 突變體蛋白比野生型NS1蛋白引起更高的INF-β 和OAS-1 轉(zhuǎn)錄,在轉(zhuǎn)染36 h,IFN-β 和OAS-1 轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到最高。 其中A549 細(xì)胞針對(duì)NS1R38A突變體蛋白誘導(dǎo)IFN-β 和OAS-1 的轉(zhuǎn)錄水平最高,A549 細(xì)胞針對(duì)NS1L144A突變體蛋白也可以誘導(dǎo)IFN-β 和OAS-1 處于較高的轉(zhuǎn)錄水平,揭示NS1R38A和NS1L144A突變體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)抑制能力較弱。 值得注意的是,第38 位和第144 位氨基酸位點(diǎn)突變,引起NS1 細(xì)胞定位不同,但對(duì)IFN-β和OAS-1 轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)作用相似。

綜上所述,H1N1 亞型SIV NS1 蛋白中第38 位和第144 位氨基酸與蛋白在細(xì)胞中的定位有關(guān),可能影響宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)。 NS1R38A和NS1L144A兩個(gè)突變體蛋白能降低NS1 蛋白抑制IFN-β 和OAS-1 的作用,表明這兩個(gè)位點(diǎn)是NS1 蛋白作用的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。