劉新橋，沙拉麥提?艾力，斯拉甫?艾白，汪波，陳亞飛，梅之南

維吾爾藥睡蓮花基原及質(zhì)量控制研究

劉新橋1，沙拉麥提?艾力2，斯拉甫?艾白3，汪波4，陳亞飛1，梅之南1

1.中南民族大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，新疆 烏魯木齊 830002；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊 830049；4.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢 430075

通過分析睡蓮花樣品的基原及特征性成分煙花苷和紫云英苷含量，為睡蓮花的基原確認(rèn)和質(zhì)量控制提供依據(jù)。以核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）為主體條形碼序列進(jìn)行基原鑒定。采用HPLC測定煙花苷和紫云英苷含量，Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為乙腈、B為0.2%磷酸溶液（含1.0%四氫呋喃），梯度洗脫（0～65 min，15%→11%A；65～75 min，11%→25%A；75～80 min，25%→15%A；80～90 min，15%A），流速1.0 mL/min，檢測波長350 nm，柱溫30 ℃。ITS2序列可將睡蓮花與其近源物種很好區(qū)分。特征性成分煙花苷和紫云英苷分離度良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定；煙花苷回歸方程為＝31.09－12.142（＝0.999 9），紫云英苷回歸方程為＝13.304－11.25（＝0.999 5），均具有良好的線性關(guān)系；重復(fù)性試驗(yàn)RSD＜2.0%；煙花苷和紫云英苷平均回收率分別為99.44%和98.88%。DNA條形碼可準(zhǔn)確鑒定維吾爾藥睡蓮花的基原，結(jié)合特征性成分煙花苷和紫云英苷含量測定，可較全面控制睡蓮花的質(zhì)量。

睡蓮花；DNA條形碼；煙花苷；紫云英苷；含量測定

睡蓮花為睡蓮科植物雪白睡蓮Presl.的干燥花蕾，主要分布于我國新疆伊犁、阿勒泰和博湖地區(qū)[1]，以及巴基斯坦、印度等國。睡蓮花為維吾爾醫(yī)習(xí)用藥，稱為“內(nèi)魯帕爾”，具有降熱止咳、益心護(hù)腦、安神止痛、祛乃孜來功效，臨床主要用于治療感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、心悸不安、咽痛或熱證引起的頭痛、熱感咳嗽及小兒急、慢驚風(fēng)等病癥，其標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)?維吾爾藥分冊》[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，睡蓮花具有抗氧化、抗炎、降血糖等多種生物活性[3-6]。據(jù)報(bào)道，黃酮類成分煙花苷和紫云英苷是睡蓮花主要的特征性成分[7]。目前，部頒標(biāo)準(zhǔn)僅收載睡蓮花的性狀及顯微鑒別方法，而傳統(tǒng)鑒別方法很難確定藥材基原。鑒于此，本研究收集19批市售睡蓮花樣品，以核糖體DNA第二內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS2）為主體條形碼序列進(jìn)行鑒定，并對藥材性狀特征進(jìn)行分析，采用HPLC測定特征性成分煙花苷和紫云英苷含量，為全面評價(jià)維吾爾藥睡蓮花的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Bio-Rad T100PCR儀，Bio-Rad公司；EPS-301凝膠電泳儀，美國Amersham公司；MM400球磨儀，德國Retsch公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器），美國Agilent公司；Agilent ZORBAX SB-Aq C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美國Agilent公司；SYZF 10L型超純水制造系統(tǒng)，成都滲源科技有限公司；CP214電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

快捷型植物基因組提取試劑盒（DP321，天根生化科技有限公司），鑒別引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR擴(kuò)增及測序引物正向5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’、反向5’-GAC GCTTCTCCAGACTACAAT-3’。煙花苷對照品（批號180603，純度＞98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司），紫云英苷對照品（批號180509，純度＞98%，上海融禾醫(yī)藥科技有限公司），甲醇（美國TEDIA，色譜純），磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純），超純水（實(shí)驗(yàn)室自制）。睡蓮花樣品于2017年4月－2018年7月于新疆全區(qū)、云南、湖北及荷蘭、巴基斯坦等地收集，見表1。

表1 睡蓮花樣品來源信息

樣品編號批號采集/收購時(shí)間產(chǎn)地/提供廠家 S1201710122017年10月巴基斯坦/和田達(dá)瓦衣店（收購） S2Y17090502017年9月湖北清大中藥飲片有限公司（廠家提供） S3Y17090222017年9月新疆維草集藥材有限公司（廠家提供） S4H301341022017年8月新疆麥迪森維藥有限公司（廠家提供） S5SLH-YP-1708302017年8月新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)飲片藥業(yè)有限公司（廠家提供） S6201707112017年7月巴基斯坦（收購） S7201709032017年9月新疆博湖（收購） S8201709062017年9月新疆和田（收購） S9201709222017年9月新疆精華維吾爾藥業(yè)有限公司（廠家提供） S10201709042017年9月新疆博湖（收購） S11201709032017年9月新疆伊犁（收購） S1217060182017年6月新疆維草集藥材有限公司（廠家提供） S13Y17090092017年9月新疆維草集藥材有限公司（廠家提供） S141704222017年4月巴基斯坦（收購） S15U8-12017年8月云南昆明（收購） S16201710112017年10月和田達(dá)瓦衣店（收購） S17201708092017年8月新疆伊犁（收購） S18201807202018年7月荷蘭Harsteeg（采集） S19201807152018年7月中國科學(xué)院武漢植物園（采集）

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀特征與鑒別

雪白睡蓮呈圓錐形或長圓形，花蕾長2.5～4 cm，直徑約2 cm，花托略呈方形；花萼4枚，革質(zhì)，長卵狀披針形，表面灰綠色或棕黃色；剝?nèi)セㄝ嗫梢姲咨ò?5～25枚，卵圓形；花藥線形，長約10 mm，花絲扁平，幾與花藥等長；子房球形或橢圓形，無花柱或極短，柱頭具6～14輻射線；氣微，味淡。

白睡蓮本種與雪白睡蓮主要區(qū)別為花托呈圓柱形；柱頭具14～20輻射線。

柔毛齒葉睡蓮本種與雪白睡蓮主要區(qū)別為萼片矩圓形；花瓣12～14枚，先端圓鈍，具5縱條紋；柱頭具12～15輻射線，具附屬物。

睡蓮本種與雪白睡蓮主要區(qū)別為花瓣寬披針形、長圓形或倒卵形；花藥條形，長3～5 mm；柱頭具5～8輻射線。

雪白睡蓮、白睡蓮、柔毛齒葉睡蓮、睡蓮的干燥花在性狀上有一定差異，但區(qū)別較小，部分品種具有連續(xù)的數(shù)量性狀特征，且干花的輻射線等特征不易觀察區(qū)分，不宜完全憑借性狀特征進(jìn)行基原鑒定。

2.2 DNA條形碼分子鑒定

2.2.1 模板DNA提取、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

按2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則9107“中藥材DNA條形碼分子鑒定法”。利用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測定OD260/OD280比值及DNA濃度。PCR反應(yīng)體系30 μL，包括10×PCR緩沖液3 μL、二氯化鎂（25 mmol/L）2.4 μL、dNTP（10 mmol/L）0.6 μL、鑒別引物（30 μmol/L）各0.5 μL、高保真Taq DAN聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、模板l μL、無菌超純水21.8 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min，循環(huán)反應(yīng)（95 ℃、30 s，55～58 ℃、30 s，72 ℃、30 s）30次，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物純化后使用ABI3730XL測序儀雙向測序，測序峰圖利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，USA）校對拼接，所有序列用MEGA6.05軟件進(jìn)行分析及ClustalW多序列比對，并用鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用bootstrap（1000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支支持率。為進(jìn)一步對物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，采用BLAST局部比對法，通過GenBank數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）對所獲ITS2序列進(jìn)行檢索，設(shè)置E值為1×10-10。

2.2.2 睡蓮花及其近源物種系統(tǒng)進(jìn)化樹鑒別

基于ITS2序列構(gòu)建的包含睡蓮科睡蓮屬睡蓮、白睡蓮、雪白睡蓮、柔毛齒葉睡蓮var.、延藥睡蓮及睡蓮科芡屬芡實(shí)、萍蓬草屬歐亞萍蓬草、萍蓬草等物種的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1。睡蓮花基原雪白睡蓮與同科近源物種能夠較好區(qū)分，雪白睡蓮聚為一支，且分支支持率達(dá)96%，ITS2序列作為DNA條形碼可準(zhǔn)確鑒定睡蓮花，將其與近源物種有效區(qū)分。睡蓮花基原雪白睡蓮及其近源物種鑒定結(jié)果見表2。

圖1 睡蓮花及其近源物種NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 睡蓮花樣品DNA分子鑒定結(jié)果

樣品編號相似度/% 鑒定結(jié)果拉丁名 S199.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S299.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S399.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S499.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S599.00柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S698.35柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S799.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S899.00柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S999.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S1089.00睡蓮Nymphaea tetragona S1193.36白睡蓮Nymphaea alba S1299.59柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S1382.00睡蓮Nymphaea tetragona S1499.00柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S1599.18柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S1699.00柔毛齒葉睡蓮Nymphaea lotus var. pubescens S1799.56白睡蓮Nymphaea alba S1898.00白睡蓮Nymphaea alba S1998.00雪白睡蓮Nymphaea candida

2.3 含量測定

2.3.1 對照品溶液制備

分別取煙花苷、紫云英苷對照品適量，精密稱定，各加甲醇制成每1 mL分別含煙花苷2.0 mg和紫云英苷0.8 mg的溶液，再分別取0.5 mL置同一25 mL容量瓶中，加適量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含煙花苷40 μg和紫云英苷16 μg的混合溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備

取本品粉末（過3號篩）約0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，置圓底燒瓶中，蒸去甲醇，加入適量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85），振搖，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，再加混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件

采用Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相A為乙腈、B為0.2%磷酸溶液（含1.0%四氫呋喃），梯度洗脫（0～65 min，15%→11%A；65～75 min，11%→25%A；75～80 min，25%→15%A；80～90 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長350 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.3.4 系統(tǒng)適用性

取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，重復(fù)測定6次，結(jié)果煙花苷、紫云英苷峰的理論塔板數(shù)平均值分別為7140、6321，峰面積RSD分別為0.44%、0.57%，符合系統(tǒng)適用性要求。

2.3.5 分離度

分別取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液及“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，供試品中煙花苷和紫云英苷峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，對照品溶液和供試品溶液代表性圖譜見圖2。

注：A.混合對照品；B.供試品；1.煙花苷；2.紫云英苷

2.3.6 檢測限和定量限

取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液，倍比稀釋，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)得檢測限，信噪比為10∶1得定量限。結(jié)果表明，煙花苷檢測限為1.0 μg/mL，定量限為3.0 μg/mL；紫云英苷檢測限為1.0 μg/mL，定量限為2.0 μg/mL。

2.3.7 線性關(guān)系考察

分別取煙花苷和紫云英苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含煙花苷2.0 mg和紫云英苷0.8 mg的混合對照品溶液，作為對照品貯備液。分別取對照品貯備液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL置25 mL容量瓶中，各加適量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度的系列對照品溶液。取各不同濃度的系列對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。煙花苷回歸方程為＝31.09－12.142（＝0.999 9），線性范圍為4.004～80.073 μg/mL；紫云英苷回歸方程為＝13.304－11.25（＝0.999 5），線性范圍為1.612～32.236 μg/mL。結(jié)果表明，煙花苷和紫云英苷進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3.8 精密度試驗(yàn)

取本品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算樣品中煙花苷和紫云英苷的含量。結(jié)果顯示，煙花苷平均含量為0.37%，RSD＝1.56%；紫云英苷平均含量為0.18%，RSD＝1.41%。表明精密度良好。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果煙花苷和紫云英苷峰面積RSD分別為1.03%、1.68%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批已知含量的睡蓮花樣品粉末，精密稱定，每份約0.50 g，置具塞錐形瓶中，分別按已知含量的80%、100%、120%加入煙花苷和紫云英苷對照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算樣品中煙花苷和紫云英苷含量及加樣回收率，結(jié)果見表3。表明本方法的回收率良好。

2.3.11 樣品測定

取19批睡蓮花樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，記錄色譜圖，計(jì)算樣品中煙花苷和紫云英苷的含量，結(jié)果見表4。

表3 煙花苷和紫云英苷加樣回收率試驗(yàn)

成分取樣量 /mg樣品中 含量/mg加入 量/mg測得 量/mg回收率 /%平均回 收率/%RSD /% 煙花苷207.80.401 50.320 80.716 898.3099.441.87 207.50.400 90.320 80.714 597.76 204.70.395 50.320 80.722 4101.91 214.50.414 40.401 00.804 797.33 206.90.399 70.401 00.808 5101.94 211.40.408 40.401 00.807 199.42 208.70.403 20.481 20.885 4100.21 210.10.405 90.481 20.874 397.34 202.40.391 00.481 20.875 9100.76 紫云英苷257.80.260 90.200 20.459 199.0098.881.67 263.50.266 70.200 20.461 297.17 259.10.262 20.200 20.460 098.80 252.50.255 50.250 20.504 999.67 264.30.267 50.250 20.512 397.85 258.70.261 80.250 20.517 7102.28 251.90.254 90.300 20.555 7100.19 264.80.268 00.300 20.561 097.61 263.20.266 40.300 20.558 797.38

表4 睡蓮花樣品中煙花苷和紫云英苷含量測定結(jié)果（%）

樣品編號煙花苷紫云英苷 樣品編號煙花苷紫云英苷 S10.110.05 S110.310.16 S20.04未檢出 S120.230.07 S30.260.08 S130.220.09 S40.170.08 S140.250.01 S50.190.08 S150.180.05 S60.240.07 S160.240.08 S70.240.08 S170.210.11 S80.16未檢出 S180.190.10 S90.220.09 S190.080.03 S100.280.09

3 討論

維吾爾藥來源復(fù)雜，在長期用藥過程中，由于翻譯錯(cuò)誤、鑒定錯(cuò)誤、代用混用等原因，藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整體偏低，藥材監(jiān)管難度大，諸多維吾爾藥材的來源無法追溯，考證難度較大。本研究收集的睡蓮花樣品主要來源于維吾爾醫(yī)藥市場，鑒定結(jié)果表明，市售睡蓮花以柔毛齒葉睡蓮居多，而部頒標(biāo)準(zhǔn)中收載的雪白睡蓮僅收集到1批。長期誤用混用不僅影響了維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)的權(quán)威性，也造成了臨床用藥安全隱患。DNA條形碼技術(shù)可追溯藥材的基原，用于藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定，在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定、藥材流通和市場監(jiān)理等實(shí)際應(yīng)用中具有重要價(jià)值。

睡蓮花藥用歷史久遠(yuǎn)，是維吾爾醫(yī)常用的單方或復(fù)方抗病毒藥的主要組成藥物，由于長期依賴于進(jìn)口，導(dǎo)致基原不清、產(chǎn)地不明，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定對于區(qū)分不同種質(zhì)資源存在一定的難度。本研究結(jié)果表明，DNA條形碼技術(shù)具有通用性強(qiáng)、鑒定結(jié)果可靠、重復(fù)性良好等優(yōu)點(diǎn)，可用于鑒定睡蓮花基原植物雪白睡蓮及其近源物種。

本研究建立了HPLC同時(shí)測定睡蓮花中特征性成分煙花苷和紫云英苷的方法。試驗(yàn)考察了不同濃度甲醇對2種成分的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇提取的含量最高，因此選擇甲醇作為提供溶劑。在耐用性試驗(yàn)中，通過改變流動相流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱溫（28、30、32 ℃）評估檢測條件的微小變動對測定結(jié)果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)流動相流速和柱溫發(fā)生較小的變化時(shí)，對煙花苷和紫云英苷含量測定結(jié)果沒有影響。

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Study on Original Plant and Quality Control of Uygur Medicine Nymphaeae Flos

LIU Xinqiao1, SHALAMAITI Aili2, SILAFU Aibai3, WANG Bo4, CHEN Yafei1, MEI Zhinan1

To comprehensively analyze the original plant of Nymphaeae Flos and the contents of two main compounds (nicotiflorin and astragalin); To provide the evidence for the origin as certainment and quality control of Nymphaeae Flos.The second inside transcription silent region (ITS2) was used as the main barcodes sequence to identify the original plant. The contents of nicotiflorin and astragalin were determined by HPLC on Agilent ZORBAX SB-Aq C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with the mobile phase of methanol (A)-0.2% phosphoric acid solution (containing 1.0% tetrahydrofuran) (B) in a gradient mode (0-65 min, 15%→11%A; 65-75 min, 11%→25%A; 75-80 min, 25%→15%A; 80-90 min, 15%A); the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelength was set at 350 nm; the column temperature was 30 ℃.The system evolutionary tree showed that ITS2 sequence could make it easy to distinguish Nymphaeae Flos from the related species. Under the established chromatographic conditions, good separation and linearity were obtained for the nicotiflorin and astragalin. The regression equations were=31.09-12.142 (=0.999 9) and=13.304-11.25 (=0.999 5); the RSD of the replicate test was less than 2.0%; the average recovery rates were 99.44% and 98.88%.DNA barcode can identify Nymphaeae Flos accurately. Combining with the content determination of the characteristic compounds of nicotiflorin and astragalin, the quality of Nymphaeae Flos can be controlled comprehensively.

Nymphaeae Flos; DNA barcode; nicotiflorin; astragalin; content determination

R284.1

A

1005-5304(2020)12-0059-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004143

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1708004）

梅之南，E-mail：meizhinan@163.com

（2020-04-06）

（2020-05-14；編輯：陳靜）