許隨根，李家鵬，李金春，陳 曦，楊君娜，熊蘇玥，黃 鑫，喬曉玲，曲 超，王守偉

（中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，國(guó)家肉類加工工程技術(shù)研究中心，肉類加工技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100068）

近年來(lái)，隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，水產(chǎn)類食品越來(lái)越受消費(fèi)者青睞，特別是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的金槍魚和鱈魚的消費(fèi)需求在不斷增長(zhǎng)。同時(shí)，魚肉制品的摻假事件被多次報(bào)道，造成消費(fèi)者的恐慌，摻假行為不僅威脅消費(fèi)者的健康和造成經(jīng)濟(jì)利益受損，還損害漁業(yè)及其國(guó)際貿(mào)易，而且也對(duì)監(jiān)管部門的執(zhí)法提出了更高技術(shù)要求[1]。魚肉產(chǎn)品摻假或稱為標(biāo)簽錯(cuò)誤標(biāo)示是一個(gè)全球性的問(wèn)題[2]，在亞洲、非洲[3]、歐洲[4]、南美洲[5]、大洋洲和北美洲[6-7]等地多國(guó)均有報(bào)道。銀鱈魚（裸蓋魚，Anoplopoma fimbria）含有大量的不飽和脂肪酸、多種必須氨基酸、多種維生素、鈣、鎂、硒等營(yíng)養(yǎng)元素[8]，營(yíng)養(yǎng)豐富，肉味甘美，易于消化，深受嬰幼兒喜愛，常作為輔食食用，市場(chǎng)上具有很高售價(jià)。關(guān)于裸蓋魚產(chǎn)品摻偽的報(bào)道很多，其中油魚（異鱗蛇鯖，Lepidocybium flavobrunneum）在摻偽魚類中最引起社會(huì)和消費(fèi)者廣泛關(guān)注，因異鱗蛇鯖外形酷似裸蓋魚，但其肌肉及內(nèi)臟富含蠟質(zhì)油脂，多吃會(huì)導(dǎo)致腹瀉，嚴(yán)重危害消費(fèi)者健康[9]。藍(lán)鰭金槍魚富含二十二碳六烯酸、二十碳五稀酸、酪胺酸、?；撬?、核酸、鐵、鈣、鉀、多種必須氨基酸和VB12等營(yíng)養(yǎng)成分[10]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，其肉質(zhì)細(xì)嫩，口感滑膩，有“金槍魚之王”的雅稱[11]，由于每種金槍魚具有不同的品質(zhì)和價(jià)格，藍(lán)鰭金槍魚在市場(chǎng)上稀缺，具有很高售價(jià)，造成不法商販以其他近似魚類以次充好售賣[12]。消費(fèi)者在購(gòu)買魚類產(chǎn)品時(shí)多基于魚鰭、魚須、體型、鰓耙數(shù)、脊骨數(shù)等外部形態(tài)特征判別魚種類，而裸蓋魚和金槍魚產(chǎn)品多以真空包裝的切塊、切片、腰肉或罐頭產(chǎn)品交易，因此監(jiān)管者和消費(fèi)者不易通過(guò)形態(tài)特征判斷其所用的原料。針對(duì)這類摻假造假的判定，傳統(tǒng)的形態(tài)特征鑒別法已經(jīng)不能滿足，必須基于更確切、精準(zhǔn)的物種鑒別基礎(chǔ)上，因此，行業(yè)急需一種靈敏、特異的藍(lán)鰭金槍魚和裸蓋魚及其制品的物種鑒定方法。

現(xiàn)今鱈魚與金槍魚的鑒定標(biāo)準(zhǔn)方法國(guó)內(nèi)僅有 SN/T 3589.6—2013《出口食品中常見魚類及其制品的鑒偽方法 第6部分：金槍魚成分檢測(cè) 實(shí)時(shí)熒光PCR法》和SN/T 3589.7—2013《出口食品中常見魚類及其制品的鑒偽方法 第7部分：鱈魚成分檢實(shí)時(shí)熒光PCR法》，金槍魚、鱈魚成分檢測(cè)實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）法，而藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖沒(méi)有快速的鑒定方法。目前，已經(jīng)報(bào)道的有關(guān)金槍魚、異鱗蛇鯖、鱈魚的分子鑒定方法有多重PCR瓊脂糖電泳法[13-14]、多重PCR聯(lián)合酶聯(lián)吸附法[15]、核苷酸測(cè)序（forensically informative nucleotide sequencing，F(xiàn)INS）法[16]、DNA條形碼法[17-18]、PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法（PCR restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）[19]和單物種熒光定量 PCR法[20-21]。多重PCR瓊脂糖電泳法靈敏度較低，近物種鑒定易出現(xiàn)假陽(yáng)性，F(xiàn)INS和DNA條形碼法需要測(cè)序[22]，鑒定周期長(zhǎng)，操作繁瑣；此外，DNA條形碼法還存在依賴參考的數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)不夠完善、核內(nèi)DNA條形碼[23]和混合物種樣品單一條形碼獲取困難等不確定因素[24]；多重PCR聯(lián)合酶聯(lián)吸附法操作繁瑣，成本較高；單物種PCR法檢測(cè)速度較快，但是檢測(cè)物種較少，每次只能檢測(cè)一個(gè)物種，而且目前建立的單物種特異性PCR多集中在大西洋鱈魚[25]、太平洋鱈魚[26]、細(xì)鱗壯鱈[27]等鱈形目鱈魚。開發(fā)滿足行業(yè)快速檢測(cè)藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的分子鑒定方法成為迫切需求。

本研究針對(duì)藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚和異鱗蛇鯖的市場(chǎng)檢測(cè)需求，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲線法，開發(fā)同時(shí)檢測(cè)藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖3 個(gè)物種的多重real-time PCR檢測(cè)方法，以期實(shí)現(xiàn)多物種的快速檢測(cè)，同時(shí)降低檢測(cè)成本，能夠滿足多樣品的快速檢測(cè)需求，具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

建立多重real-time PCR方法體系所用魚類和畜禽肉：4 種金槍魚、劍旗魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖由北京水產(chǎn)公司遠(yuǎn)洋捕撈隊(duì)提供；燕鲅魚、鮐鲅魚、青魚、草魚、鳙魚、鰱魚各1 種，來(lái)源于北京岳各莊水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；豬肉采購(gòu)于北京二商大紅門肉類食品有限公司；牛、綿羊、山羊肉來(lái)源于北京月盛齋清真食品有限公司；雞、鴨肉購(gòu)于北京永輝超市。

1.1.2 試劑

動(dòng)物組織基因組D N A 提取試劑盒 天根生物 （北京）技術(shù)有限公司；LightCycler?480 real-time PCR反應(yīng)管、SYBR Green酶體系預(yù)混液 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；無(wú)水乙醇 北京化工集團(tuán)；DNeasy Blood & Tissue Kit DNA提取試劑盒 凱杰企業(yè)管理 （上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多樣品剪切均質(zhì)勻漿儀 美國(guó)歐姆尼公司；ME104分析天平 梅特勒-托利多（北京）公司；Vortex-Genie2渦旋振蕩器 美國(guó)Scientific Industries公司；NanoDROP one超微量分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技有限公司；RocheLight Cycler 480 PCR儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；T100TMThermal Cycler型PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)公司；Eppendorf Centrifuge 5417R離心機(jī) 艾本德中國(guó)有限公司；Cascada BIO超純水系統(tǒng) 美國(guó)頗爾公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的處理及基因組DNA的提取

將魚去鱗片，畜禽肉去筋膜，取肌肉剪碎，準(zhǔn)確稱取3 g肉，加水12 mL，調(diào)整均質(zhì)儀10 000 r/min勻質(zhì)10 min，取1.5 mL離心管吸取150 μL勻漿液于其中，8 000 r/min離心1 min，去上清液，然后按照試劑盒說(shuō)明書操作提取DNA，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 目標(biāo)物種的引物設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站獲取6 種金槍魚、8 種鱈魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖、刺鱗蛇鯖等26 種魚類線粒體DNA序列，利用Mega 7.1軟件進(jìn)行序列比對(duì)，選擇序列差異大的區(qū)域利用軟件Oligo 7.56設(shè)計(jì)特異性引物。設(shè)計(jì)的引物在NCBI網(wǎng)站通過(guò)BLAST程序進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物同源性及特異性比對(duì)，比較不同引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值并選取擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值差異顯著的引物用于實(shí)驗(yàn)。最終，藍(lán)鰭金槍魚的特異性引物設(shè)計(jì)在線粒體DNA的D-loop區(qū)，裸蓋魚的特異性引物設(shè)計(jì)在線粒體DNA的16S rRNA基因，異鱗蛇鯖的特異性引物設(shè)計(jì)在線粒體DNA的ND4L基因，所有引物由賽默飛世爾科技中國(guó)合成（表1）。

表1 目標(biāo)物種的引物信息Table 1 Information about primers for target species used in this study

1.3.3 設(shè)計(jì)引物的特異性驗(yàn)證

利用提取的各物種基因組DNA作為模板，進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增。采用10 μL的PCR體系，其中SYBR Green酶體系預(yù)混液5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，模板DNA 2 μL，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至10 μL。 real-time PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸共計(jì)45 s，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)；熔解峰圖制作：95 ℃變性1 min，降溫至70 ℃、1 min，之后均勻速率（0.02 ℃/s）升溫至95 ℃，并連續(xù)采集各溫度下的熒光值；然后，60 s內(nèi)降溫至40 ℃。以溫度為橫坐標(biāo)，熒光值對(duì)溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作熔解峰值圖[28]。

1.3.4 多重real-time PCR體系建立

選取藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物，首先優(yōu)化退火溫度、循環(huán)數(shù)等擴(kuò)增條件，已往文獻(xiàn)報(bào)道多重PCR擴(kuò)增過(guò)程中各引物對(duì)存在相互競(jìng)爭(zhēng)的關(guān)系，引物濃度對(duì)多重real-time PCR能否擴(kuò)增目標(biāo)物種起重要作用，在多重PCR體系中調(diào)配合適的引物濃度能夠有效避免個(gè)別物種漏檢情況的發(fā)生[29]，據(jù)此設(shè)計(jì)系列不同濃度梯度的引物組合體系，根據(jù)各組合系統(tǒng)所產(chǎn)生的峰圖高度調(diào)整不同物種引物濃度，以出現(xiàn)平滑、基本等高且特異的峰值圖為標(biāo)準(zhǔn)，選定最優(yōu)組合體系。如表2所示，采用25 μL的PCR體系，其中SYBR Green酶體系預(yù)混液12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各4.2 μL（上下游引物為藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖特異性引物按比例混合組成），模板DNA 2 μL，加無(wú)菌重蒸水補(bǔ)足至25 μL。real-time PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火和延伸共計(jì)45 s，重復(fù)35 個(gè)循環(huán)；熔解峰圖制作：95 ℃變性1 min，降溫至70 ℃保持1 min，之后均勻速率（0.02 ℃/s）升溫至95 ℃，并連續(xù)采集各溫度下的熒光值；然后，60 s內(nèi)降溫至40 ℃。以溫度為橫坐標(biāo)，熒光值對(duì)溫度的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)為縱坐標(biāo)，制作熔解峰值圖。

表2 引物配比及各組分添加量（總體積25 μL）Table 2 Ingridents and formulation of PCR reaction system (total volume 25 μL)

1.3.5 多重real-time PCR檢測(cè)的靈敏度

將藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的DNA溶液梯度稀釋，分別配制5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL DNA溶液，開展靈敏度檢測(cè)；制備藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚與異鱗蛇鯖的肉粉，按比例混合分別配制成含藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的混合肉樣，提取DNA開展相對(duì)檢出限靈敏度檢測(cè)。

1.3.6 多重real-time PCR體系實(shí)際應(yīng)用效果驗(yàn)證

采購(gòu)金槍魚、鱈魚的鮮品切片、切塊以及罐頭制品，購(gòu)置金槍魚鮮品13 份，裸蓋魚切塊9 份，烤鱈魚片8 份，金槍魚罐頭5 份，鱈魚類罐頭5 份。利用所建立的多重real-time PCR檢測(cè)方法測(cè)定其藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，每次做2 個(gè)平行。所有數(shù)據(jù)采用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 設(shè)計(jì)引物的特異性驗(yàn)證

分別使用藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物對(duì)藍(lán)鰭金槍魚、黃鰭金槍魚、馬蘇金槍魚、大目金槍魚、三文魚、黃魚、草魚、鰱魚、鳙魚、鯉魚、青魚、異鱗蛇鯖、燕鲅魚、鮐鲅魚、劍旗魚、豬、牛、綿羊、山羊、雞、鴨的DNA（5 ng/μL）進(jìn)行 real-time PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示3 對(duì)特異性引物只對(duì)各自陽(yáng)性物種DNA產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，而對(duì)其他物種DNA無(wú)典型擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的特異性引物具有很好特異性。將3 對(duì)引物混合后對(duì)22 個(gè)物種DNA進(jìn)行多重real-time PCR檢測(cè)驗(yàn)證，擴(kuò)增結(jié)果見 圖1，檢測(cè)結(jié)果與單一引物檢測(cè)結(jié)果相同，表明3 對(duì)引物在多物種擴(kuò)增中也具有很好的特異性，不同物種源性成分的Tm值相差顯著。擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量和片段長(zhǎng)度的差異是造成這種差異的主要因素，為利用多重real-time PCR熔解曲線分析法建立摻假檢測(cè)方法提供理論基礎(chǔ)。DNA的Tm大小與其均一性、GC含量及介質(zhì)中的離子強(qiáng)度等因素有關(guān)，所以離子濃度固定的溶液中，短鏈DNA的Tm值受其濃度、片段長(zhǎng)度和GC含量的影響[30]。而長(zhǎng)片段DNA則在變性過(guò)程中主要發(fā)生局部解鏈，首先解鏈低GC含量的部分，通常40～100 bp被認(rèn)定為一個(gè)熔解單元[31]。片段大小超過(guò)100 bp后，GC含量和溶液濃度是影響DNATm值的主要因素。另外，種內(nèi)個(gè)體變異只會(huì)發(fā)生幾個(gè)堿基的突變，相應(yīng)造成Tm值的變化也較?。ㄍ锓N內(nèi)不同個(gè)體DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm測(cè)定誤差范圍為0～0.3 ℃）。因此，基于熔解曲線分析法不需判定片段內(nèi)堿基序列的變異，只考慮特異性引物是否設(shè)計(jì)在的種內(nèi)保守區(qū)，相比PCR-RFLP、熒光探針?lè)ê虳NA條形碼技術(shù)，本方法的優(yōu)點(diǎn)也在此處[32-34]。

多重real-time PCR方法檢測(cè)物種源性成分的能力與其反應(yīng)重?cái)?shù)密切相關(guān)。real-time PCR反應(yīng)重?cái)?shù)越多，各引物對(duì)的相互競(jìng)爭(zhēng)就越激烈，real-time PCR體系的檢測(cè)能力越容易受到限制。目前，已報(bào)道的研究中real-time PCR重?cái)?shù)在5 重及以下，因此，研究者為了利用盡量少的引物對(duì)同步檢測(cè)盡可能多的物種源性成分，往往將特異性引物設(shè)計(jì)在屬特異種保守的序列處，從而提高所開發(fā)方法的檢測(cè)靈敏度和通量，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的異鱗蛇鯖引物采用此策略，使其能檢測(cè)異鱗蛇鯖和刺鱗蛇鯖。引物特異性驗(yàn)證的結(jié)果見表3。

圖1 real-time PCR體系的特異性Fig. 1 Specificity of the established real-time PCR system

表3 引物特異性驗(yàn)證結(jié)果Table 3 Statistical results of specificity verification of primers

2.2 多重real-time PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

配制藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的混合肉樣（各物種源性成分含量比例相同，物種組合見表4）， 提取各樣品D N A，以提取的D N A 為模板進(jìn)行多重 real-time PCR擴(kuò)增，并分析熔解曲線，再次驗(yàn)證所建多重real-time PCR體系的特異性，同時(shí)確定各物種成分熔解溫度（Tm）分布范圍。分析各樣品熔解曲線圖，結(jié)果如圖2、3所示，所檢樣品的熔解曲線峰位置、峰個(gè)數(shù)均與樣品的物種源性成分組成相對(duì)應(yīng)，均沒(méi)有非特異性峰出現(xiàn)的現(xiàn)象，進(jìn)一步表明建立的多重real-time PCR體系具有很好的特異性。3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)并計(jì)算各物種源性成分的Tm值，計(jì)算結(jié)果見表4。實(shí)驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)不同引物濃度體系、不同模板濃度中3 種魚類的Tm值分布情況，由統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知3 種魚類源性成分的熔解溫度分布段分別為藍(lán)鰭金槍魚源性成分Tm值（74.98±0.60）℃、裸蓋魚源性成分Tm值（78.65±0.71）℃、異鱗蛇鯖源性成分Tm值（82.38±0.25）℃，各物種源性成分的Tm值均有偏移，異鱗蛇鯖源性成分的Tm值漂移范圍最小，為0.5 ℃，裸蓋魚源性成分的Tm值漂移范圍最大，為1.42 ℃，整體看來(lái)各物種源性成分的Tm值偏移跨度較小，表明所建方法穩(wěn)定性較好；各物種源性成分Tm值范圍之間相互不交叉，因此，分析所檢測(cè)樣品熔解曲線，根據(jù)譜圖中溶解峰數(shù)和溫度范圍（即峰的位置）能準(zhǔn)確判定所檢樣品中含有的物種。

表4 混合魚肉樣品中各魚類成分熔解溫度值Table 4 Melting temperature values of fish components in mixed fish samples

圖2 多重real-time PCR檢測(cè)各混合樣DNA的熔解曲線Fig. 2 Melting curves of DNA in mixed samples detected by multiplex real-time PCR

圖3 所建real-time PCR體系檢測(cè)3 種魚類混合DNA的熔解曲線Fig. 3 Melting curves of mixed DNA of three fishes detected by real-time PCR

2.3 多重real-time PCR檢測(cè)方法的靈敏度

以制備成5、0.5、0.05、0.005、0.000 5 ng/μL的藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的質(zhì)量濃度梯度DNA樣品和3 魚類混合DNA溶液為模板，進(jìn)行多重real-time PCR擴(kuò)增及熔解曲線分析，測(cè)試多重real-time PCR的DNA濃度靈敏度；由圖4A可知，藍(lán)鰭金槍魚各質(zhì)量濃度梯度樣品的Tm分別為（75.37±0）、（75.47±0.20）、（75.38±0.04）、（75.88±0.01）、（76.24±0.11）℃； 由圖4 B 可知，裸蓋魚各濃度梯度樣品的Tm分別為（78.45±0）、（78.47±0.01）、（78.64±0.01）、（79.20±0.08）、（79.27±0.01）℃；由圖4C可知，異鱗蛇鯖各濃度梯度樣品的Tm分別為（82.1±0.01）、（82.07±0.01）、（82.11±0.04）、（82.26±0.01）、（82.47±0.01）℃。三者的Tm值均在各自的溫度范分布圍內(nèi)，由此可知采用本方法多重real-time PCR體系檢測(cè)單物種DNA，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分的檢出限均為0.001 ng。由圖4D可知，采用本方法多重real-time PCR體系測(cè)定混合樣DNA溶液，10 ng混合DNA為模板，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（74.49±0.04）、（78.09±0.05）、82.23±0.02）℃， 1 ng混合DNA為模板，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（74.90±0.04）、（78.46±0.05）、（82.30±0.02）℃，0.1 ng混合DNA為模板，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖的Tm分別為（75.61±0.01）、（79.0±0.02）、（82.46±0.01）℃，三者的Tm值均在各自的溫度分布范圍內(nèi)，可知本方法檢測(cè)多物種時(shí)，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖源性成分的檢出限為0.1 ng。

以含藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖成分50%、10%、5%、1%、0.5%、0.10%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度混合樣品的DNA為模板，開展多重real-time PCR擴(kuò)增，并分析熔解曲線，測(cè)試所建多重real-time PCR體系的相對(duì)檢出限，測(cè)試結(jié)果顯示采用所建多重real-time PCR體系檢測(cè)混合樣品DNA，藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖源性成分的檢出限分別為0.5%、1%、0.5%。

本研究開發(fā)的多重real-time PCR檢測(cè)方法的檢出限與周彤等[35]開發(fā)的多重real-time PCR檢出肉制品中動(dòng)物源性的檢出限相當(dāng)，均能做到多物種檢出限0.1 ng。已有 文獻(xiàn)[36]報(bào)道0.1 ng DNA的檢出限能充分滿足魚制品摻假檢測(cè)的需求。

圖4 所建多重real-time PCR的靈敏度檢測(cè)Fig. 4 Sensitivity evaluation of multiplex real-time PCR

2.4 多重real-time PCR體系實(shí)際應(yīng)用效果驗(yàn)證

為檢驗(yàn)所建方法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用效果，并更進(jìn)一步驗(yàn)證所建多重real-time PCR的準(zhǔn)確性。用本方法對(duì)采集的市售金槍魚切塊、裸蓋魚切塊、烤鱈魚片、鱈魚罐頭類、金槍魚罐頭類樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，Tm值在（74.98±0.60）℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（藍(lán)鰭金槍魚源性成分）的有4 份樣品；Tm值在（78.65±0.71）℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（裸蓋魚源性成分）的有8 份樣品；Tm值在（82.38±0.25） ℃范圍內(nèi)出現(xiàn)熔解峰（異鱗蛇鯖源性成分）的有6 份樣品；3 個(gè)Tm值范圍內(nèi)均未出現(xiàn)熔解峰的樣品22 份。

表5 市場(chǎng)采購(gòu)水產(chǎn)品的檢測(cè)結(jié)果Table 5 Results of detection of aduleration in commercial aquatic products

從樣品分類及結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析（表5）可以看出，金槍魚切塊、裸蓋魚切塊、烤鱈魚片、金槍魚罐頭、鱈魚罐頭中均存在標(biāo)簽錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)或者摻偽，錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)或者摻偽率達(dá)22.5%，所有檢測(cè)樣品中烤鱈魚片的摻偽或者標(biāo)簽錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)率最高，高達(dá)37.5%。金槍魚切塊制品中有產(chǎn)品標(biāo)識(shí)為白金槍魚切塊，而檢測(cè)結(jié)果顯示實(shí)際物種為異鱗蛇鯖；烤鱈魚片和罐頭類制品的摻假也多數(shù)采用鯰魚、異鱗蛇鯖等其他廉價(jià)或相似魚種冒充。以上結(jié)果證明所建方法在實(shí)際樣品檢驗(yàn)中具有很好應(yīng)用效果，該多重real-time PCR體系用于實(shí)際水產(chǎn)品的快速鑒別準(zhǔn)確有效。

3 結(jié) 論

本研究針對(duì)藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚和異鱗蛇鯖的市場(chǎng)檢測(cè)需求，基于3 種魚類的線粒體基因序列，利用SYBR Green real-time PCR的熔解曲線法開發(fā)了同時(shí)檢測(cè)藍(lán)鰭金槍魚、裸蓋魚、異鱗蛇鯖3 個(gè)物種的多重real-time PCR檢測(cè)方法。該方法實(shí)現(xiàn)了多物種的快速檢測(cè)，同時(shí)降低檢測(cè)成本，能夠滿足多樣品的快速檢測(cè)需求。所建的多重real-time PCR檢測(cè)方法具有很高靈敏度和很好的識(shí)別度，在實(shí)際水產(chǎn)樣品的檢測(cè)中也顯示了不錯(cuò)的應(yīng)用效果。所建方法能為監(jiān)管機(jī)構(gòu)快速檢測(cè)水產(chǎn)類制品的物種提供技術(shù)支持，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可供執(zhí)法部門作為參考依據(jù)，同時(shí)提高市場(chǎng)監(jiān)管部門打擊水產(chǎn)制品摻假的效率，使其能夠有效加強(qiáng)水產(chǎn)品的監(jiān)管，保護(hù)消費(fèi)者的健康，保證相關(guān)企業(yè)與消費(fèi)者經(jīng)濟(jì)不受損；此外，所建方法為漁業(yè)正確識(shí)別所捕撈魚類物種提供技術(shù)支持，從而改善目前金槍魚、鱈魚市場(chǎng)真實(shí)產(chǎn)品物種與標(biāo)識(shí)物種不符的亂象，因此，所建方法會(huì)有很好的應(yīng)用前景。