王大力，曹金明，張君，孫耐，王文婷，顧平

1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院，河北唐山063000；2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

抑郁癥是一種常見的精神疾病，全球有超過3億人罹患抑郁癥，是世界范圍內(nèi)的首要致殘?jiān)?。藥物治療是重型抑郁的主要治療措施，但臨床治愈率僅有30%～40%[1]。目前研究表明,抑郁癥患者常伴隨神經(jīng)退行性變和神經(jīng)發(fā)生減少[2]。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)能進(jìn)行自我更新，并具有向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的潛能。當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到各種生理、病理刺激時(shí)，NSCs將被激活，這對腦損傷和治療神經(jīng)退行性疾病具有重要意義[3]。研究表明，壓力、糖皮質(zhì)激素及抑郁癥時(shí)會(huì)影響腦內(nèi)NSCs的增殖、分化，并對其造成損傷，進(jìn)一步影響抑郁癥的治療及預(yù)后[4]。艾司西酞普蘭(ESC)是一種新型高選擇性的5-羥色胺(5-HT)再攝取抑制劑(SSRIs)，通過抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)5-HT的再攝取產(chǎn)生抗抑郁作用，但對去甲腎上腺素、多巴胺及細(xì)胞色素P450酶抑制作用小，所以安全性較其他SSRIs好，藥物相互作用少[5]。目前發(fā)現(xiàn)氟西汀、氟伏沙明及西酞普蘭等對NSCs具有促進(jìn)存活及增殖的作用，但ESC對NSCs存活和增殖是否有影響少見報(bào)道。本研究觀察了ESC對新生大鼠海馬NSCs存活和增殖的影響，為臨床治療抑郁癥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器及試劑 出生24 h內(nèi)新生SD大鼠4只,購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SCXK(冀2018-004)。7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Napco公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；正置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；ESC原研藥(丹麥靈北制藥有限公司)；DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(美國PeproTech公司)；B27 Supplement(美國Gibco公司)；雞抗巢蛋白(Nestin)抗體(美國Abcam公司)；RNA提取試劑盒(美國Promega公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司)；MTS試劑盒(美國Promega公司)；山羊封閉血清(北京中杉金橋公司)；多聚賴氨酸(北京索萊寶公司)。

1.2 NSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定 在無菌條件下，取上述4只SD大鼠兩側(cè)海馬，置于預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液中；解剖顯微下剝離血管和腦膜，將分離出的海馬組織放入另一個(gè)預(yù)冷的DMEM/F12培養(yǎng)液中，緩慢輕柔吹打15～20次后成單細(xì)胞懸液；置于離心機(jī)中，1 000 r/min離心5min，棄上清，加入無血清的NSCs培養(yǎng)基(DMEM/F12+2%B27+20 ng/mL bFGF)重懸；細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×104/mL接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，再置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代分離出的NSCs呈單細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)3 d需半量補(bǔ)液，發(fā)現(xiàn)3～5個(gè)細(xì)胞聚集呈球形或不規(guī)則形狀。培養(yǎng)7～10 d，神經(jīng)球由15～20個(gè)細(xì)胞聚集。培養(yǎng)5～7 d后第1次傳代，收集神經(jīng)球后胰酶消化成單細(xì)胞，計(jì)數(shù)后傳代，傳代比例約1∶2。選取第3代的NSCs用于實(shí)驗(yàn)，其神經(jīng)球呈規(guī)則圓形，體積明顯增大，折光性強(qiáng)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰。用干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白Nestin對第3代細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示神經(jīng)球內(nèi)大多數(shù)細(xì)胞呈Nestin染色陽性。

1.3 細(xì)胞分組及處理 實(shí)驗(yàn)分為對照組和艾司西酞普蘭干預(yù)組(ESC組)。對照組：NSCs仍在無血清的NSCs培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；ESC組：NSCs中加入不同濃度ESC干預(yù)，培養(yǎng)液分別為DMEM/F12+2%B27+不同濃度(5、10、20、40 μmol/L)ESC。

1.4 大鼠海馬NSCs存活率測算及ESC最佳濃度篩選 采用MTS法。將消化后NSCs細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞個(gè)數(shù)為104個(gè)/孔，每孔100 μL培養(yǎng)液。分為對照組和5、10、20、40 μmol/L ESC組進(jìn)行接種，每組5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)5 d后，在每孔中加20 μL CellTiter 96?AQueous One SolutionReagent,避光，5% CO2、37 ℃溫箱中培養(yǎng)2 h后應(yīng)用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測每孔的光密度值(OD值)，根據(jù)OD值計(jì)算出存活率。MTS檢測重復(fù)3次，取每組平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對照組及5、10、20、40 μmol/L ESC組細(xì)胞存活率分別為(100.00+0.00)%、(107.56±0.38)%、(108.36±0.23)%、(166.69±0.30)%、(166.48±0.42)%，20、40 μmol/L ESC組細(xì)胞存活率較對照組增加(P均<0.05)，但20、40 μmol/L ESC組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示20 μmol/L ESC最有益于NSCs的存活。

1.5 大鼠海馬NSCs細(xì)胞存活情況觀察 將對照組和20 μmol/L ESC組的NSCs消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整為105/mL接種至12孔板中，加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)混勻后進(jìn)行染色。在染色3 min內(nèi)計(jì)數(shù)活細(xì)胞及死細(xì)胞數(shù)目，鏡下觀察見活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成淡藍(lán)色，隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)算活細(xì)胞率。用活細(xì)胞率來表示細(xì)胞活力，連續(xù)計(jì)數(shù)5 d，觀察細(xì)胞存活情況。

1.6 大鼠海馬NSCs細(xì)胞活力檢測 通過記錄每天對照組和20 μmol/L ESC組細(xì)胞數(shù)目來評價(jià)細(xì)胞活力。將兩組生長良好接近匯合的細(xì)胞，消化吹打成單細(xì)胞懸液并調(diào)至為1×105/mL接種于12孔板，每組共接種15孔，每24 h計(jì)數(shù)1次細(xì)胞，每組每次分別計(jì)數(shù)3個(gè)孔，計(jì)算平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)5 d，繪制兩組NSCs的生長曲線。

1.7 大鼠海馬NSCs Nestin陽性細(xì)胞球檢測 將對照組、20 μmol/L ESC組的NSCs培養(yǎng)5 d后，以1×105個(gè)/孔分別接種到提前包被多聚賴氨酸的24孔板里培養(yǎng)，6～8 h NSCs貼壁，進(jìn)行免疫熒光染色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。將各組細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS緩沖液洗5 min，洗3次；再加入4%多聚甲醛室溫固定15 min；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次；然后山羊血清37 ℃孵育40 min；加入Nestin一抗(1∶100)，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次，加入熒光二抗山羊抗雞FITC(1∶100)，37 ℃避光孵育30 min；0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次；Hoechst染核3～5 min；再用0.01 mol/L PBS緩沖液洗3次，5 min/次，封片。熒光顯微鏡觀察。每個(gè)孔隨機(jī)觀察5個(gè)非重疊視野。用平均每個(gè)視野的Nestin陽性細(xì)胞球比較兩組增殖情況。

1.8 大鼠海馬NSCs Nestin mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR技術(shù)。各取對照組、20 μmol/L ESC組5×106個(gè)細(xì)胞，提取總RNA，嚴(yán)格按試劑盒說明操作；反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20 μL，包含4 μL 5×miScritHiSpec溶液、2 μL 10×miScritNucleics混合液、2 μL miScript反轉(zhuǎn)錄混合液、2 μL無RNA酶水和10 μL模板RNA。以β-actin為內(nèi)參，利用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。每組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。反應(yīng)條件：95 ℃變性15 min，94 ℃變性15 s、58 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，重復(fù)32次循環(huán)。β-actin上游引物序列：5′-CCGCGAGTACAACCTTCTTG-3′，下游引物序列：5′-TGACCCATACCCACCATCAC-3′；Nestin上游引物序列：5′-GGGGGTAGGAGATGCCTTTG-3′，下游引物序列：5′-CCTTTAGAGCACCCACCTCC-3′。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 ESC對大鼠海馬NSCs存活情況的影響 臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)對照組及20 μmol/L ESC組的活/死細(xì)胞數(shù)目，可見兩組細(xì)胞存活率均在99%以上，對照組1～5 d的存活率分別為(99.23±0.44)%、(99.17±0.45)%、(99.24±0.07)%、(99.11±0.57)%、(99.24±0.19)%，ESC組分別為(99.30±0.05)%、(99.31±0.21)%、(99.26±0.16)%、(99.13±0.08)%、(99.18±0.27)%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 ESC對大鼠海馬NSCs增殖的影響 對照組1～5 d細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為(1.00±0.00)×105、(1.15±0.02)×105、(1.25±0.03)×105、(1.52±0.02)×105、(2.06±0.02)×105個(gè)，20 μmol/L ESC組分別為(1.00±0.00)×105、(1.24±0.09)×105、(1.76±0.01)×105、(2.49±0.02)×105、(3.52±0.06)×105個(gè)。兩組NSCs的生長均呈持續(xù)增長趨勢，在傳代的1～2 d，細(xì)胞增殖速度平緩，培養(yǎng)3～5 d時(shí)，細(xì)胞增殖速度明顯加快，且ESC組的細(xì)胞數(shù)目及斜率高于對照組，說明ESC能促進(jìn)NSCs的增殖(P<0.05)。

對照組、20 μmol/L ESC組Nestin陽性神經(jīng)球個(gè)數(shù)分別為(18.33±1.25)、(35.00±0.82)個(gè)，兩組比較P<0.05。

2.3 ESC對大鼠海馬NSCs Nestin mRNA表達(dá)的影響 對照組、20 μmol/L ESC組Nestin mRNA相對表達(dá)量分別為1.00±0.03、6.23±0.16，兩組比較P<0.05。

3 討論

抑郁癥又稱抑郁障礙，以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征，是世界首位的致殘疾病，其危害程度遠(yuǎn)超心腦血管疾病、糖尿病、癌癥等疾病。國際抑郁癥流行病學(xué)大數(shù)據(jù)調(diào)研顯示，其終生患病率為8%～12%，而且呈逐年上升趨勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者存在腦容量減少、腦室擴(kuò)大、神經(jīng)元凋亡及部分腦皮質(zhì)及邊緣系統(tǒng)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞減少等現(xiàn)象，提示抑郁癥存在神經(jīng)退行性改變[6]。目前認(rèn)為，發(fā)育中及成年哺乳動(dòng)物中室管膜、海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層下區(qū)、嗅球及皮質(zhì)等區(qū)域存在具有自我更新和分化潛能的NSCs，且在一定因素的影響下，NSCs可以大量增殖并持續(xù)數(shù)周[7]。然而，無論是嚙齒類動(dòng)物還是人類,在壓力、糖皮質(zhì)激素及應(yīng)激的刺激下，腦內(nèi)NSCs增殖能力下降，嚴(yán)重時(shí)將對其造成損傷[4]，主要表現(xiàn)為海馬等部位萎縮和神經(jīng)元數(shù)量減少，并伴有樹突、突觸的重塑及膠質(zhì)細(xì)胞的改變等[6]。近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥則很有可能通過誘導(dǎo)海馬新生神經(jīng)元的產(chǎn)生，促進(jìn)成年大腦邊緣皮層正常功能的恢復(fù)而發(fā)揮臨床療效。那么，抑郁藥是否直接調(diào)控NSCs的增殖及其作用機(jī)制均為研究重點(diǎn)[8]。本研究利用體外培養(yǎng)環(huán)境單一、條件易控的優(yōu)勢，以新生SD大鼠海馬來源的NSCs作為細(xì)胞模型；穩(wěn)定傳至第3代，免疫熒光染色顯示NSCs神經(jīng)球Nestin表達(dá)強(qiáng)陽性，證明成功完成NSCs的體外原代分離、培養(yǎng)與鑒定，能為后續(xù)試驗(yàn)的順利開展奠定基礎(chǔ)。

研究報(bào)道，有些SSRI類抗抑郁藥物可以逆轉(zhuǎn)抑郁癥導(dǎo)致的海馬神經(jīng)增生受損，具有促進(jìn)NSCs增殖及神經(jīng)發(fā)生的作用。例如，100 pmol/L～1 μmol/L的氟西汀能促進(jìn)海馬NSCs增殖并存在劑量依賴效應(yīng)[9，10]；1 nmol/L氟伏沙明能顯著提高體外培養(yǎng)NSCs的存活率[11]；帕羅西汀通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)不僅提高NSCs增殖能力，還促進(jìn)NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞以外的神經(jīng)元分化[12]；舍曲林雖對NSCs增殖無影響，但能保護(hù)NSCs免受脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，具有促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和保護(hù)NSCs的作用[13]；西酞普蘭能逆轉(zhuǎn)抑郁癥模型中海馬神經(jīng)發(fā)生的改變，這種改變與行為改善的時(shí)間過程相似，其與褪黑素聯(lián)合應(yīng)用降低了海馬齒狀回血漿皮質(zhì)酮水平，增加了細(xì)胞增殖、存活率和相關(guān)新神經(jīng)元的絕對數(shù)量[14]。此外，西酞普蘭可通過增加NSCs增殖和存活率從而促進(jìn)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)元分化，增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)元特性[15]。1.0 μmol/L和0.5 μmol/L西酞普蘭干預(yù)7 d，能顯著促進(jìn)胚胎大鼠海馬神經(jīng)前體細(xì)胞增殖與分化。ESC是一新型的SSRIs，與其他SSRIs不同的是，ESC減少了西酞普蘭右旋異構(gòu)體對左旋異構(gòu)體與突觸前膜結(jié)合位點(diǎn)的干擾，進(jìn)一步增加了5-HT的釋放，繼而通過5-HT的受體促進(jìn)海馬內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的恢復(fù)，從而達(dá)到高效抗抑郁焦慮的作用。5-HT被認(rèn)為是調(diào)節(jié)成年海馬神經(jīng)發(fā)生的物質(zhì)，外源性5-HT還可挽救成人體內(nèi)NSCs增殖[16]。研究表明，在重度抑郁老鼠模型中，給予ESC治療后大鼠海馬5-HT表達(dá)增加，抑郁樣行為顯著減少[17]。隨著年齡的增長，5-HT能神經(jīng)傳遞的減少會(huì)增加老年人群患抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的風(fēng)險(xiǎn)，然而經(jīng)ESC治療的大腦較正常衰老的大腦轉(zhuǎn)錄發(fā)生、顆粒細(xì)胞增殖、血管收縮相關(guān)基因及激素反應(yīng)相關(guān)基因增加，促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù)，對神經(jīng)細(xì)胞存活、增殖具有重要作用[18]。腦卒中后抑郁大鼠的海馬NSCs增殖減少，給予ESC治療3周后發(fā)現(xiàn)此大鼠海馬齒狀回NSCs增殖顯著提高[19]。ESC對慢性低灌注大鼠的缺血區(qū)細(xì)胞增殖具有促進(jìn)作用，增加了突觸結(jié)合蛋白及突觸小泡蛋白含量，并對三維血管分布、細(xì)胞形態(tài)及血漿血管內(nèi)皮生長因子具有正性調(diào)控作用，可改善神經(jīng)發(fā)生的微環(huán)境，對神經(jīng)系統(tǒng)的完善起重要作用[20]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20 μmol/L的ESC對NSCs具有較好的促存活作用；生長曲線顯示ESC組細(xì)胞數(shù)目顯著高于對照組，增殖速率也明顯高于對照組，提示20 μmol/L的ESC有促進(jìn)NSCs增殖的作用；進(jìn)一步免疫熒光染色和RT-PCR結(jié)果顯示，20 μmol/L的ESC促進(jìn)NSCs表達(dá)Nestin，表明一定濃度的ESC具有促進(jìn)體外培養(yǎng)NSCs存活和增殖的作用。

綜上所述，20 μmol/L的ESC可正性調(diào)控新生大鼠海馬NSCs的存活和增殖。在后續(xù)的研究工作中，將深入探討ESC促進(jìn)NSCs增殖和存活的分子機(jī)制及其能否促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元方向分化等問題。