李小松，姜濤

吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長春130033

肝細(xì)胞癌(HCC)是最常見的癌癥之一，是全球第二大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。隨著影像技術(shù)的進(jìn)步，HCC的診斷率大幅上升。近三分之一的HCC患者接受根治性手術(shù)切除或肝移植，對于術(shù)后復(fù)發(fā)和中晚期喪失手術(shù)機(jī)會的患者則可選擇如射頻消融、經(jīng)動脈化療栓塞術(shù)、索拉非尼等常規(guī)治療，但總的來說，HCC患者生存預(yù)后并不樂觀。而目前針對免疫檢查點(diǎn)的腫瘤免疫治療成為了HCC治療的新希望。在眾多免疫檢查點(diǎn)信號因子中，程序性死亡蛋白-1/程序性死亡蛋白-1配體(PD-1/PD-L1)在腫瘤免疫過程中發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移。許多研究表明腫瘤患者中PD-L1高表達(dá)與生存率高度相關(guān)[2,3]，PD-1/PD-L1有希望作為臨床預(yù)后標(biāo)志物?，F(xiàn)就PD-1/PD-L1在HCC中的免疫作用機(jī)制及其對HCC預(yù)后判斷作用研究進(jìn)展予以綜述。

1 PD-1/PD-L1在HCC中的免疫作用機(jī)制

腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制是腫瘤增殖和逃避免疫系統(tǒng)的主要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞利用多種免疫抑制途徑來抵抗腫瘤免疫，其中一種方式是通過PD-1/PD-L1軸，PD-1/PD-L1是重要的“免疫檢查點(diǎn)”[4]。慢性乙型肝炎病毒感染是肝硬化和HCC的主要病因之一[1]。乙肝病毒可引起慢性病毒性炎癥、纖維化和肝硬化，并最終導(dǎo)致HCC的發(fā)生。在慢性乙型肝炎病毒感染期間，持續(xù)的固有和適應(yīng)性免疫反應(yīng)有助于免疫耐受和腫瘤的增殖。PD-1/PD-L1通路在慢性感染、腫瘤免疫逃逸和腫瘤微環(huán)境的形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[5]。PD-1是CD28家族成員之一，有PD-L1、PD-L2(也稱為B7-H1、B7-DC)兩種配體，具有共刺激分子的特性。雖然與PD-1/PD-L1相比，PD-1/PD-L2高出2～6倍的親和力，但PD-L1仍被認(rèn)為是PD-1的主要配體[6]。PD-1是一種免疫共抑制受體，表達(dá)于T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和髓系細(xì)胞上。在T細(xì)胞上，PD-1通過與其配體PD-L1和PD-L2的相互作用抑制T細(xì)胞的活化[7]。PD-L1在樹突狀細(xì)胞上表達(dá)，廣泛存在于血管、心肌、肺、胎盤等組織中。而PD-L2的表達(dá)僅限于樹突狀細(xì)胞、感染或免疫反應(yīng)(如炎癥)的晚期激活階段，在T細(xì)胞上選擇性表達(dá)。PD-1在周圍組織的效應(yīng)T細(xì)胞中表達(dá)尤為強(qiáng)烈。與PD-1不同的是，PD-L1在免疫反應(yīng)發(fā)生過程中在正常的外周組織和大多數(shù)免疫細(xì)胞中都有廣泛性表達(dá)。相反，PD-L2的表達(dá)是選擇性的，局限于抗原提呈細(xì)胞，參與了淋巴結(jié)T細(xì)胞活化。因此，PD-1和PD-L1抗體在免疫治療中同樣有效，而PD-L2發(fā)揮作用有限。在T細(xì)胞介導(dǎo)免疫過程中，T細(xì)胞識別腫瘤細(xì)胞上MHC分子所表達(dá)的腫瘤抗原后被激活，釋放穿孔蛋白和顆粒酶，進(jìn)而攻擊腫瘤細(xì)胞,同時(shí)激活T細(xì)胞釋放γ-干擾素和其他細(xì)胞因子。在這些細(xì)胞因子的作用下，癌細(xì)胞上調(diào)PD-L1的表達(dá)，使其與T細(xì)胞上的PD-1結(jié)合，從而減弱T細(xì)胞的攻擊。PD-L1與PD-1結(jié)合后，在腫瘤細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞上異常高表達(dá)，激活PD-1 /PD-L1通路減弱T細(xì)胞抗腫瘤活性，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡；抑制顆粒酶和穿孔素生產(chǎn)；減少γ-干擾素、腫瘤壞死因子等分泌；致細(xì)胞周期停滯不前；最終導(dǎo)致免疫逃逸或免疫耐受。癌細(xì)胞是如何誘導(dǎo)PD-L1在抗原細(xì)胞上表達(dá)，其機(jī)制尚不明確。與傳統(tǒng)的化療和分子靶向治療不同，免疫治療利用了人體免疫系統(tǒng)的天然抗腫瘤反應(yīng)，旨在維持和加強(qiáng)其作用[8～10]。PD-L1抗體與PD-1抗體作用類似。免疫調(diào)節(jié)通路中大量共刺激分子的產(chǎn)生多呈現(xiàn)出兩種形式，即膜結(jié)合形式和可溶性形式。分子的可溶性形式通常由共刺激蛋白的膜結(jié)合形式的蛋白水解而產(chǎn)生，如可溶性腫瘤壞死因子[11]和sB7-H3[12]，或通過翻譯選擇性剪接mRNA產(chǎn)生，如sB7-2和sCTLA-4。同樣，PD-1/PD-L1的可溶性形式也得到了證實(shí)。PD-1/PD-L1通路分子包括膜結(jié)合形式PD-1/PD-L1(mPD-1/mPD-L1)和可溶性PD-1/PD-L1(sPD-1/sPD-L1)，在腫瘤的T細(xì)胞免疫反應(yīng)中都發(fā)揮重要免疫抑制作用[13～15]。

2 PD-1/PD-L1在HCC患者不同治療預(yù)后中的作用

2.1 手術(shù)切除治療 隨著人們對PD-1/PD-L1通路在腫瘤免疫的重要性的逐步認(rèn)識，越來越多研究探討了腫瘤細(xì)胞上PD-1、PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系。2009年，Gao等[16]研究選擇接受手術(shù)切除治療的HCC患者，通過免疫組化對腫瘤組織標(biāo)本中PD-1、PD-L1表達(dá)進(jìn)行評估，進(jìn)而探討PD-1、PD-L1表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。此研究包括240例接受手術(shù)切除的HCC患者，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)陽性的患者無病生存期(DFS)和總生存期(OS)明顯低于PD-L1表達(dá)陰性的患者。PD-L1陽性患者的DFS和OS中位數(shù)分別為14.9、29.6個月，而PD-L1陰性患者的DFS和OS中位數(shù)分別為59.4、14.9個月。與PD-L1陰性患者相比，PD-L1陽性患者復(fù)發(fā)的可能性幾乎是PD-L1陰性患者的兩倍。在晚期肝內(nèi)復(fù)發(fā)患者中，PD-L1是高度相關(guān)免疫標(biāo)志物，顯著高于非復(fù)發(fā)患者(P=0.007)。PD-L1表達(dá)與患者DFS、OS有高度相關(guān)性，PD-L1高表達(dá)的患者會出現(xiàn)更差的臨床預(yù)后結(jié)果。Wu等[17]的研究同樣證實(shí)了PD-L1高表達(dá)與較差的生存率高度有關(guān)。有的研究還發(fā)現(xiàn)，PD-L1的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤正相關(guān)[18～20]，這也驗(yàn)證了PD-1/PD-L1軸在T細(xì)胞活化過程中的作用。多個研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達(dá)與病毒載量正相關(guān)[21,22]，PD-1可以使慢性乙型肝炎病毒感染患者發(fā)生基因變異最終導(dǎo)致肝硬化[23]。Pei等[24]的研究也進(jìn)一步證實(shí)了PD-L1的表達(dá)與肝硬化顯著相關(guān)(P=0.016)。

但在之后的多個研究[19～22,24～27]發(fā)現(xiàn)，PD-L1與生存期無明顯相關(guān)，不能作為臨床預(yù)后指標(biāo)。甚至有些研究表明PD-L1高表達(dá)與較好的生存期相關(guān)[28～30]，與之前研究結(jié)果正好相反。這些研究結(jié)果之間的不一致可能歸于多個原因。我們深入分析發(fā)現(xiàn)，多項(xiàng)研究在檢測抗體和用于檢測PD-L1表達(dá)的染色模式有很大區(qū)別。例如,Gao等的研究利用小鼠抗PD-L1抗體用于免疫組化分析，然而他們并沒有區(qū)分HCC腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中PD-L1染色情況,只是根據(jù)面積和顏色密度粗略地定義“高”和“低”的PD-L1表達(dá)。而且目前采用免疫組化染色強(qiáng)度或密度評分的方法來定義腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)陽性的方法已經(jīng)過時(shí)，現(xiàn)為了簡化PD-L1表達(dá)陽性的定義標(biāo)準(zhǔn)，專家提出使用陽性細(xì)胞表達(dá)百分比≥1%[31]作為臨界值，之后Nivolumab的臨床試驗(yàn)便采用了此方法[32]。另外，檢測抗體不一致同樣會造成研究結(jié)果的差異。最近幾項(xiàng)采用陽性細(xì)胞表達(dá)百分比定義PD-L1表達(dá)陽性的研究顯示，PD-L1表達(dá)與OS高度相關(guān)[33,34]。最新的一項(xiàng)meta分析[35]也指出，PD-L1高表達(dá)的患者有較差生存率，PD-L1與DFS(HR=2.07,95%CI:1.20～3.58,P=0.009)及OS(HR=1.57,95%CI:1.09～2.27,P<0.00001)顯著相關(guān)，此meta分析還指出PD-L1的表達(dá)與肝硬化顯著相關(guān)。綜上所述，PD-1/PD-L1作為預(yù)后生物標(biāo)志物仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2 其他常規(guī)治療 眾所周知，只有少部分的HCC患者可以手術(shù)治療，而絕大多數(shù)非轉(zhuǎn)移的HCC患者采用的治療方法如射頻消融、經(jīng)肝動脈化療栓塞等治療[36]。由于HCC患者的肝活檢并不是常規(guī)項(xiàng)目，在這樣的情況下，PD-1或PD-L1表達(dá)通過免疫組化染色測定是存在困難的。我們還發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境的PD-L1陽性癌細(xì)胞或PD-L1陽性的非腫瘤細(xì)胞在HCC中可能并不均勻分布。腫瘤組織的一部分可能是PD-L1陽性，而另一部分可能是陰性，而目前活檢標(biāo)本的范圍，無法準(zhǔn)確描述PD-L1表達(dá)的分布情況。這些限制都導(dǎo)致了PD-1/PD-L1相關(guān)研究對于非手術(shù)患者的臨床價(jià)值，而此時(shí)血清中sPD-1/sPD-L1顯示出特有的價(jià)值。Finkelmeier等[37]通過研究215例經(jīng)過射頻消融或動脈化療栓塞治療后患者的血清，發(fā)現(xiàn)血清中sPD-L1水平高的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增加(HR=3.34,95%CI：1.61～6.93,P<0.001)，而sPD-L1水平低的患者預(yù)后較好。此外還發(fā)現(xiàn)sPD-L1與巨噬細(xì)胞活化(sCD163)和炎癥(C反應(yīng)蛋白)的標(biāo)志物表達(dá)呈正相關(guān)。之后的數(shù)項(xiàng)研究證明，血清中sPD-L1水平與OS高度相關(guān)，低水平的患者預(yù)后更好[38～40]。Kim等[38]還發(fā)現(xiàn)，放療后1個月sPD-L1水平升高與早期肺轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P=0.015)。另一研究觀察到多個炎性細(xì)胞因子(IL-10、IL-17、TNF-α)和sPD-1或sPD-L1呈正相關(guān)[40]。Han等[39]觀察到，有乙型肝炎背景的HCC患者血清中sPD-L1水平明顯高于健康對照組；同時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤組織PD-L1高表達(dá)患者的血清sPD-L1水平也隨之升高，但由于sPD-L1來源的多樣性，血清sPD-L1水平與腫瘤組織PD-L1表達(dá)僅呈中度正相關(guān)。目前，sPD-L1的檢測多采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA),但其臨界值尚無統(tǒng)一結(jié)論，需要更多臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

2.3 免疫治療 最近研究表明，各種惡性腫瘤患者在接受免疫治療后可取得一定效果。然而，部分癌癥患者存在低反應(yīng)和免疫相關(guān)的不良事件。這就需要開發(fā)一類生物標(biāo)志物來預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的相關(guān)事件發(fā)生情況。雖然目前研究有限，但已經(jīng)發(fā)表了一些初步研究。如最近報(bào)道的一項(xiàng)回顧性研究包括290例HCC患者，145例接受手術(shù)治療，其余145例接受手術(shù)聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞灌注(CIK)治療。結(jié)果表明，在接受手術(shù)切除聯(lián)合CIK灌注治療的患者中，PD-1高表達(dá)與OS和DFS高度相關(guān)[27]，而單純手術(shù)患者PD-1/PD-L1表達(dá)與生存預(yù)后無明顯相關(guān)性。另一項(xiàng)對448例HCC患者[單純肝切除術(shù)217例(手術(shù)組)、肝切除術(shù)同時(shí)術(shù)后CIK細(xì)胞輸注231例(聯(lián)合治療組)]的對照研究表明，PD-L1陽性患者在聯(lián)合治療組的OS更好，而在手術(shù)組沒有顯著差異[21]。上述兩項(xiàng)研究都顯示，在單純肝切除術(shù)患者中PD-1/PD-L1表達(dá)與DFS/OS之間沒有關(guān)聯(lián)。由此可以看出，PD-1/PD-L1的檢測在HCC的免疫治療中有重要臨床意義。然而，最近的CheckMate 040試驗(yàn)顯示，以1%為臨界值，PD-L1表達(dá)水平與接受Nivolumab治療的晚期HCC患者的應(yīng)答率之間沒有顯著關(guān)聯(lián)。174例患者中只有20%的患者PD-L1陽性，PD-L1表達(dá)陽性組與陰性組相比，患者預(yù)后無顯著差異。導(dǎo)致此結(jié)果的原因可能是，研究人員免疫組化染色只量化了癌細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)，忽略了腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞也可表達(dá)PD-L1的事實(shí)。因此在未來的臨床試驗(yàn)中，需要更加細(xì)致評估各種免疫相關(guān)細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。

綜上所述，雖然PD-1/PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后有一定關(guān)系，但是作為預(yù)后標(biāo)志物仍受到許多因素的限制，如通過免疫組化方式檢測PD-1/PD-L1表達(dá)會受到各方面的干擾(檢測抗體的選擇、不同臨界值、組織的制備、腫瘤微環(huán)境中免疫相關(guān)細(xì)胞的染色問題等)；且血清中sPD1/sPD-L1面臨著來源復(fù)雜、臨界值尚不明確等問題。以上這些問題都需要進(jìn)一步的臨床研究來驗(yàn)證。隨著PD-1/PD-L1研究不斷的深入，我們相信PD-1和PD-L1將會在HCC的預(yù)后判斷方面發(fā)揮更大的作用。