李忠慧

（新疆畜牧科學(xué)院生物技術(shù)研究所，烏魯木齊 830000）

綿羊作為重要的家畜經(jīng)濟(jì)動物，羊毛是其主要的高附加值產(chǎn)品。羊毛是一種純天然、可再生、可降解的綠色環(huán)保型纖維，具有天然的透氣性及吸收、釋放空氣、濕氣的獨(dú)特能力。同時，由于羊毛纖維柔軟有彈性，使得羊毛制品具有保暖性強(qiáng)、穿著輕柔等特點(diǎn)。澳洲美利奴羊毛作為世界上品質(zhì)最好的羊毛，與其他羊毛相比，更為纖細(xì)柔軟，毛色白而有光澤，富有彈性。隨著我國國民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和居民收入水平的不斷提高，居民消費(fèi)能力不斷提升，人們對羊毛等動物纖維服飾產(chǎn)品的需求量不斷增長和對羊毛的質(zhì)量要求也不斷提高，我國已然成為羊毛生產(chǎn)加工大國和消費(fèi)大國。但是由于我國的羊毛產(chǎn)量偏低、進(jìn)口量大，羊毛細(xì)度、長度、毛色等品質(zhì)不高，我國羊毛產(chǎn)業(yè)無法滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，培育和改良毛用綿羊品種以滿足生產(chǎn)生活需求尤為重要。

在經(jīng)濟(jì)動物的品種培育過程中，現(xiàn)代生物技術(shù)手段有助于縮短育種時間、快速提高和改善動物生產(chǎn)性能。基因編輯作為現(xiàn)代生物技術(shù)的重要手段之一，是近年基于基因組和基因信息技術(shù)發(fā)展起來的通過人工設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)對特定基因或基因組靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)編輯的前沿技術(shù)，目前已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)動物育種和模式動物等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在動物育種領(lǐng)域，由于傳統(tǒng)育種手段的增產(chǎn)潛力已接近極限，利用高效穩(wěn)定的基因編輯技術(shù)創(chuàng)新育種手段和提升現(xiàn)代動物育種效率及技術(shù)水平，對于育種新材料的創(chuàng)制和品種培育至關(guān)重要。

1 羊毛發(fā)育過程及其分子調(diào)控

羊毛生長的“發(fā)源地”是毛囊，毛囊作為哺乳動物皮膚重要的微型附屬器官，其組織結(jié)構(gòu)和性狀決定了毛發(fā)的生長和品質(zhì)。毛囊可分為兩種不同類型，即初級毛囊和次級毛囊，一般認(rèn)為初級毛囊生長毛，而次級毛囊生長絨。毛囊的發(fā)育可分為誘導(dǎo)期、器官發(fā)生期和細(xì)胞分化期三個時期[1]，依次經(jīng)歷形成毛囊基板、真皮凝集物、真皮乳頭，最終形成完整成熟的毛囊、腺體和肌肉結(jié)構(gòu)[2-3]。毛囊發(fā)育完成后，即進(jìn)入周期性生長循環(huán)階段，包括生長期（細(xì)胞快速增值、毛干快速生長）、退行期（細(xì)胞的增殖分化和毛干的生長趨于停滯）和休止期（細(xì)胞增殖停滯、毛干脫落）[4-5]。而毛囊的周期性生長發(fā)育過程受到復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。近年來，有關(guān)哺乳動物毛囊發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究已取得較大進(jìn)展，研究發(fā)現(xiàn)，Hox 基因、BMP 基因、β-連環(huán)蛋白基因、KAP 基因以及Wnt 信號通路、Notch 信號通路、FGF 信號通路等均參與調(diào)控毛囊的生長發(fā)育，他們之間構(gòu)成一個龐大復(fù)雜而又精準(zhǔn)的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖譜，每個基因之間緊密聯(lián)系、相互制約，為毛囊發(fā)生及周期性循環(huán)提供必要保障。因此，在現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的時代，利用基因編輯等先進(jìn)的技術(shù)手段研究調(diào)控毛發(fā)生長相關(guān)的功能基因，可為培育和改良毛用羊品種提供更多的科學(xué)支持。

2 CRISPR/cas9基因編輯技術(shù)

CRISPR/cas9 技術(shù)作為目前最流行的基因編輯技術(shù)，是人們從細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一把可以高效而精準(zhǔn)地修改生命藍(lán)圖的利刃，是對靶向基因進(jìn)行特定DNA 修飾的技術(shù)。該基因編輯技術(shù)系統(tǒng)主要由Cas9 核酸酶和sgRNA 組成。Cas9 核酸酶具有切割雙鏈DNA 的活性結(jié)構(gòu)域，使得雙鏈DNA 斷裂；sgRNA 是由起支架功能的tracrRNA 與特異性的crRNA 結(jié)合形成嵌合RNA。CRISPR/cas9 技術(shù)就像是一把“生物剪刀”，在sgRNA作用下通過RNADNA 堿基互補(bǔ)配對將Cas9/sgRNA 復(fù)合物靶向募集到目的基因，Cas9 再通過識別目的基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）定點(diǎn)切割雙鏈DNA，進(jìn)而對目標(biāo)基因定向刪除、突變或插入新的基因片段，具有高效、快捷、精準(zhǔn)、特異性高等特點(diǎn)。通過這一技術(shù)，不僅大大降低對動物進(jìn)行基因敲除、基因修飾的難度，更是將動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)由傳統(tǒng)的隨機(jī)整合推向了高度精確的基因組定向刪除、突變或插入，開創(chuàng)了轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的新時代。因此，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)自出現(xiàn)以來，便快速地應(yīng)用于綿羊等經(jīng)濟(jì)動物的基因編輯研究。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在羊毛品質(zhì)改良中的應(yīng)用

運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)編輯與羊毛生長性狀相關(guān)的功能基因以獲得基因編輯綿羊，該過程一般包括以下幾個步驟：（1）利用sgRNA 在線設(shè)計(jì)軟件，針對目標(biāo)基因上的PAM序列（5'-NGG-3'）設(shè)計(jì)sgRNA，并合成sgRNA 序列；（2）制備合成Cas9 mRNA；（3）利用體外受精等技術(shù)獲得受精卵；（4）利用顯微注射技術(shù)將sgRNA 和Cas9 mRNA注射入受精卵內(nèi)，并置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)受精卵；（5）將胚胎移植至受體母羊體內(nèi)發(fā)育成長；（6）待羔羊出生后檢測基因編輯情況。

已有研究發(fā)現(xiàn)，屬于成纖維細(xì)胞生長因子FGFs（一類調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的多功能肽類生長因子）家族成員之一的FGF5基因，被認(rèn)為在毛發(fā)生長過程中抑制毛發(fā)的生長期，而突變FGF5基因則可導(dǎo)致毛囊生長期延長，促進(jìn)毛發(fā)生長，從而提高羊毛產(chǎn)量、改善羊毛品質(zhì)。因此，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)胚胎注射獲得21只FGF5靶向編輯的陜北白絨山羊，對其絨長性狀進(jìn)行檢測的結(jié)果表明，F(xiàn)GF5 基因靶向編輯的絨山羊的絨毛長度和密度等指標(biāo)顯著高于野生型絨山羊[6]；本課題組運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)對中國美利奴細(xì)毛羊的FGF5 基因進(jìn)行編輯，共獲得16 只FGF5 基因功能失活的基因編輯羔羊，其中12只存活超過1年。羊毛性狀檢測結(jié)果表明，12 只基因編輯細(xì)毛羊的羊毛毛叢自然長度及其伸直長度顯著長于同齡、正常野生型細(xì)毛羊，且產(chǎn)毛量顯著高于野生型細(xì)毛羊[7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)毛囊黑色素細(xì)胞合成褐黑素的ASIP 基因拷貝數(shù)或基因表達(dá)水平的變化能夠改變細(xì)毛羊的毛色，通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯ASIP基因獲得了不同顏色和毛色圖案的彩色細(xì)毛羊[8]，證明修飾ASIP基因能夠?qū)崿F(xiàn)毛色的定向改變，是培育彩色細(xì)毛羊的一條有效、可行的技術(shù)途徑。此外，除了FGF5 基因和ASIP基因，毛纖維性狀相關(guān)基因的其他基因，如VEGF、Tβ4、PRL、LCE7A、MOGAT2、MOGAT3等基因均可通過CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行精準(zhǔn)編輯以制備和選育性狀優(yōu)良的綿羊品種。

4 展 望

傳統(tǒng)的綿羊品種培育主要是通過基于表型選擇的雜交改良等常規(guī)育種技術(shù)，雖在一定程度上取得了育種效果，但是這種育種手段周期長、預(yù)見性差、選擇效率低，在培育新品種方面難度較大，而且在大動物基因組上實(shí)現(xiàn)修飾和改造的成本和技術(shù)要求高。CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)自出現(xiàn)以來，其高效、快捷、精準(zhǔn)、特異性高的特點(diǎn)大大縮短育種時間，加快育種進(jìn)程，同時為動物遺傳育種、基因組學(xué)研究、疾病防控等方面提供了新的研究思路。但目前對基因編輯技術(shù)來說，最重要的還是能夠合理利用和監(jiān)管基因編輯，保障其安全性，推動社會生產(chǎn)。

5 小 結(jié)

羊毛細(xì)度、長度、毛色等品質(zhì)的改良，在人類生活中使得人們有更多的機(jī)會選擇舒適度更高、加工工藝更多樣的羊毛產(chǎn)品，進(jìn)一步滿足了人類對高品質(zhì)生活的追求。因此，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)對羊毛相關(guān)目的基因進(jìn)行定向精準(zhǔn)編輯，將是提高羊毛產(chǎn)量和改善羊毛品質(zhì)的一種有效的精準(zhǔn)分子育種途徑。