劉亞青，令調(diào)文，王天成

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，蘭州730000

甘油二酯(DAG)是細(xì)胞膜上重要的第二信使，其重要作用之一就是激活蛋白激酶C，在基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞膜運(yùn)輸和神經(jīng)遞質(zhì)釋放等方面發(fā)揮著重要作用。在體內(nèi)，DAG水平主要通過(guò)被二酰甘油激酶(DGKs)磷酸化為磷脂酸或被DAG脂肪酶代謝來(lái)調(diào)節(jié)。磷脂酸作為磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的代謝前體，能夠激活磷脂酰肌醇激酶并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，如雷帕霉素靶蛋白和Ras鳥(niǎo)嘌呤三磷酸酶激活蛋白等，同時(shí)也被認(rèn)為是影響神經(jīng)傳遞的重要調(diào)節(jié)因子。DGKs通過(guò)磷酸化DAG生成磷脂酸在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用，由于其底物和產(chǎn)物均是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，因此對(duì)其結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控的研究近幾年來(lái)備受關(guān)注。DGKs家族的一個(gè)重要特性是其不同亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有各自的時(shí)空表達(dá)特異性和疾病相關(guān)性，被認(rèn)為可能是某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在治療靶點(diǎn)。迄今為止，已在哺乳動(dòng)物中鑒定出10種DGKs亞型，目前主要根據(jù)其調(diào)控域不同將其分為5種亞型?，F(xiàn)就DGKs不同亞型在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能與相關(guān)疾病研究進(jìn)展綜述如下。

1 Ⅰ型DGKs

1.1 DGKα DGKα是惟一在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的在膠質(zhì)細(xì)胞而非神經(jīng)元中表達(dá)的DGKs亞型，尤其是在少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而少突膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘的生成并與炎癥反應(yīng)相關(guān)。同時(shí)，研究顯示DGKα與髓鞘的主要成分之一髓鞘堿性蛋白共定位，表明DGKα可能參與少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘的產(chǎn)生、調(diào)控或維持過(guò)程[1]。Poli等[2]發(fā)現(xiàn)，核內(nèi)DGKα活性或表達(dá)的改變可以改變視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白的磷酸化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換，而這種細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換停止通常會(huì)導(dǎo)致凋亡或自噬，提示核DGKα參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)維生素E可以通過(guò)激活DGKα減輕野生型小鼠糖尿病神經(jīng)病變的部分癥狀，而在DGKα-/-鼠中并未發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，提示DGKα為糖尿病神經(jīng)病變免疫治療的潛在靶點(diǎn)[3]。目前關(guān)于DGKα的研究更多集中于腫瘤和免疫領(lǐng)域，而在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究相對(duì)較少。

1.2 DGKβ DGKβ在神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于嗅球、皮層、紋狀體和海馬神經(jīng)元中，隨著突觸的發(fā)生、發(fā)育表達(dá)水平逐漸增高，并在小鼠出生后14 d腦內(nèi)突觸形成的過(guò)程中顯著升高，具有獨(dú)特的膜定位[4]。研究顯示，在海馬和紋狀體中，DGKβ主要積聚在神經(jīng)元樹(shù)突棘的突觸周圍[5]。在DGKβ敲除小鼠的海馬中，隨著DAG的累積和磷脂酸含量的降低，神經(jīng)元樹(shù)突分支和棘突的數(shù)目均少于野生小鼠。此外，在原代培養(yǎng)的DGKβ敲除小鼠海馬神經(jīng)元中，神經(jīng)元樹(shù)突分支和棘突數(shù)量明顯減少，而這種情況可以被過(guò)表達(dá)的DGKβ所挽救，過(guò)表達(dá)的DGKβ可以促進(jìn)體外培養(yǎng)第7天的樹(shù)突生長(zhǎng)和第14天樹(shù)突棘的成熟，后續(xù)研究也得到了同樣的結(jié)果，表明DGKβ在神經(jīng)突觸形成中的重要作用[6,7]。事實(shí)上，早在2001年人們就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了人類DGKβ的16個(gè)剪接變異體，而其中一個(gè)位于C末端的35個(gè)氨基酸缺失的剪接變異與雙相情感障礙(BD)相關(guān)[8]。此外，研究顯示DGKβ可能通過(guò)影響中間神經(jīng)元參與癲癇易感性過(guò)程，經(jīng)戊四氮和海人酸點(diǎn)燃的DGKβ敲除鼠較野生型表現(xiàn)出更嚴(yán)重的癲癇發(fā)作，這些敲除鼠海馬CA3區(qū)的小白蛋白陽(yáng)性中間神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，這對(duì)小鼠癲癇易感性的增加作出了部分解釋；同時(shí)，在敲除鼠的腦皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)棘密度較野生型明顯降低，小鼠表現(xiàn)出躁狂樣行為，而這種異常行為可以被鋰劑或哌甲酯部分逆轉(zhuǎn)[9]。以上結(jié)果均提示，DGKβ通過(guò)影響神經(jīng)突觸或中間神經(jīng)元參與多種神經(jīng)精神疾病，可能是研究BD和注意缺陷/多動(dòng)障礙的有效動(dòng)物模型。

1.3 DGKγ 免疫組化結(jié)果顯示，大鼠出生后的腦中即存在DGKγ免疫反應(yīng)性，在嗅球、中隔核、海馬和小腦中發(fā)現(xiàn)其強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)性，表明DGKγ在這些腦區(qū)高表達(dá)。出生后隨著腦發(fā)育,DGKγ的免疫反應(yīng)性逐漸增加，但直到第28天的小腦浦肯野細(xì)胞中才出現(xiàn)DGKγ顯著表達(dá)，與浦肯野細(xì)胞樹(shù)突狀分支的生長(zhǎng)時(shí)間段一致，這提示DGKγ可能與神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育相關(guān)。亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)其位于浦肯野細(xì)胞的胞體和樹(shù)突胞質(zhì)。類似的研究顯示，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y中DGKγ定位于細(xì)胞胞質(zhì)，海馬神經(jīng)元中定位于胞質(zhì)和近端樹(shù)突。然而，Matsubara等[10]研究發(fā)現(xiàn)DGKγ隨時(shí)間存在細(xì)胞內(nèi)易位，C1結(jié)構(gòu)域在這種核轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中不可或缺。研究顯示，DGKγ激酶陰性突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞體積變大、增長(zhǎng)速度變慢、S期延長(zhǎng)，表明核內(nèi)DGKγ參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，與同屬Ⅰ型DGKs的DGKα在核內(nèi)的研究結(jié)果相一致。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞N1E-115中的研究發(fā)現(xiàn)，DGKγ的C端與神經(jīng)元軸突末端的絲狀偽足生長(zhǎng)有關(guān)，在胞質(zhì)內(nèi)與微管微絲肌動(dòng)蛋白F-actin共定位，提示其可能對(duì)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育有影響[11]。截至2018年，從運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能受損的DGKγ敲除鼠中分離出小腦浦肯野細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)敲除鼠較野生型的樹(shù)突分支數(shù)量和長(zhǎng)度減少，再次從體內(nèi)研究證實(shí)了DGKγ對(duì)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育的影響[12]。

2 Ⅱ型DGKs

2.1 DGKδ Natalia等[13]在1例12歲患有癲癇伴發(fā)育遲緩史、先天性毛細(xì)血管異常、輕度肌張力低下并伴有肥胖的女性患者中發(fā)現(xiàn)了染色體t(X；2)(p11.2；q37)的平衡易位，該斷點(diǎn)破壞了位于2q37的DGKD(編碼蛋白為DGKδ)。通過(guò)原位雜交檢測(cè)成年小鼠腦內(nèi)DGKδ的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)在孕12.5 d的小鼠中腦和前腦組織中DGKδ顯著表達(dá)，其在大腦皮層和海馬錐體神經(jīng)元以及小腦顆粒細(xì)胞神經(jīng)元中尤為突出，提示DGKδ與神經(jīng)發(fā)育和腦病理生理相關(guān)；研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GKD純合子突變小鼠的前腦和中腦組織中無(wú)DGKδ表達(dá)，小腦中僅有微弱表達(dá)，而其中50%的突變小鼠表現(xiàn)出異常的癲癇樣放電和癲癇發(fā)作，這些研究結(jié)果表明DGKδ參與癲癇發(fā)作的過(guò)程。此外，DGKδ還與脂肪生成和2型糖尿病相關(guān)，或許可以對(duì)前述提及存在DGKD破壞患者[13]的表型做出部分解釋。

2.2 DGKη DGKη在腦中表達(dá)最為豐富，在大腦皮層、海馬(CA1、CA2)和齒狀回區(qū)域、嗅球以及1～32周齡小鼠的小腦浦肯野細(xì)胞中均有高表達(dá)。目前，關(guān)于DGKη與疾病的研究主要集中于BD和腫瘤兩個(gè)方向。Baum等[14]在對(duì)兩個(gè)獨(dú)立BD病例樣本進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究時(shí)，在DGKη的第一個(gè)內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)關(guān)聯(lián)信號(hào)，首次提出DGKη與BD的相關(guān)性。此后，多項(xiàng)不同國(guó)家的病例研究均證實(shí)了兩者之間的相關(guān)性。Isozaki等[15]通過(guò)構(gòu)建DGKη敲除小鼠并對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，小鼠表現(xiàn)出類似于BD躁狂狀態(tài)的總體行為學(xué)特征如多動(dòng)、焦慮減少和抑郁狀態(tài)減少，而這些表型通過(guò)服用鋰劑后明顯改善，再次證實(shí)DGKη與BD相關(guān)，然而具體的病理生理機(jī)制尚未明確闡明。

2.3 DGKκ DGKκ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中幾乎沒(méi)有表達(dá)，但在睪丸中尤其是初級(jí)和次級(jí)精母細(xì)胞中表達(dá)最高，胎盤(pán)中也發(fā)現(xiàn)有表達(dá)[16]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)DGKκ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)與疾病相關(guān)的研究。

3 Ⅲ型DGKs(DGKε)

DGKε是目前已知所有DGKs中最小且結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的亞型，不同于其他DGKs亞型，其分子結(jié)構(gòu)沒(méi)有調(diào)控域而是具有一個(gè)疏水域，特別偏好在sn-2位置帶有花生四烯醇(20∶4)基團(tuán)的二酰甘油底物，是所有DGKs中惟一具有底物特異性的亞型，也被認(rèn)為與其他DGKs亞型之間的功能重疊最小。DGKε在神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)和分布于小腦浦肯野細(xì)胞、海馬錐體細(xì)胞、嗅球和黑質(zhì)神經(jīng)元，由于其在腦組織中高表達(dá)，表明它可能在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。事實(shí)上，早在2001年Turco等[17]就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)DGKε-/-小鼠較DGKε野生型小鼠表現(xiàn)出對(duì)電休克更高的抵抗力、更短時(shí)間的強(qiáng)直發(fā)作和更快的恢復(fù)時(shí)間。與此相一致，Musto等[18]在類似的研究中得到同樣的結(jié)果，通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)DGKε是通過(guò)調(diào)節(jié)花生四烯醇肌醇脂質(zhì)信號(hào)和突觸的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)來(lái)參與癲癇易感性的發(fā)生過(guò)程。此外，Zhang等[19]研究顯示編碼DGKε的DGKE shRNA在果蠅亨廷頓病(HD)模型中的表達(dá)挽救了亨廷頓蛋白(Htt)毒性所致部分運(yùn)動(dòng)損傷，還在HD小鼠模型的紋狀體中發(fā)現(xiàn)DGKE mRNA表達(dá)水平較高(Htt過(guò)度表達(dá))。這表明DGKε的活性增強(qiáng)在HD發(fā)病過(guò)程中也起一定作用，可能與Htt N端的多聚谷氨酸擴(kuò)張導(dǎo)致紋狀體和皮層神經(jīng)元大量丟失有關(guān)。

4 Ⅳ型DGKs

4.1 DGKζ DGKζ也是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中研究最深入的DGKs亞型之一，在小腦、海馬錐體細(xì)胞和齒狀顆粒細(xì)胞、嗅球以及致密大腦皮層中高表達(dá)。在神經(jīng)元內(nèi)，DGKζ通過(guò)其PDZ結(jié)構(gòu)域與突觸后支架蛋白PSD-95相互作用，并在興奮性突觸中特異表達(dá)。DGKζ過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致樹(shù)突棘數(shù)量顯著增多，而敲除后則樹(shù)突棘減少，這種效應(yīng)主要依賴于DGKζ的催化活性和與PSD95的結(jié)合[20]。類似的研究顯示，DGKζ的過(guò)表達(dá)不僅可以通過(guò)影響前白蛋白(PA)水平，還能與Rac1、PAK1等相互作用或形成復(fù)合物來(lái)參與誘導(dǎo)N1E-115細(xì)胞的軸突生長(zhǎng)[21]。在DGKZ(編碼蛋白為DGKζ)敲除小鼠的海馬切片中發(fā)現(xiàn)，CA1區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘密度顯著降低，Schaffer側(cè)支CA1區(qū)錐體突觸顯示出長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)作用減弱，提示DGKζ在神經(jīng)元突觸可塑性中的重要作用[22]。行為學(xué)觀察顯示，經(jīng)海人酸誘導(dǎo)的DGKZ 敲除癲癇小鼠模型相比于野生型小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的驚厥發(fā)作和海馬神經(jīng)元細(xì)胞死亡，表明DGKζ同前述部分DGKs亞型一樣與癲癇易感性有關(guān)[23]。另一方面，最近在非神經(jīng)元細(xì)胞中也檢測(cè)到DGKζ的免疫反應(yīng)。最新研究顯示，DGKζ在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和致瘤性中起至關(guān)重要的作用，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中DGKζ的mRNA和蛋白水平均顯著高于癌前病變，進(jìn)一步通過(guò)慢病毒shRNA干擾DGKζ后發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖速度減慢并誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期停滯。這表明DGKζ可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖，從而參與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的形成過(guò)程，提示DGKζ可能作為惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的潛在靶點(diǎn)[24]。

4.2 DGKι DGKι因其羧基末端含有4個(gè)類似于DGKζ的錨蛋白重復(fù)序列，因此與DGKζ同歸為Ⅳ型DGKs亞型。Ito等[25]通過(guò)Northern免疫印跡分析其在腦組織中的分布及mRNA定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，在所檢測(cè)的11個(gè)組織中，僅在大腦和眼組織中檢測(cè)到其mRNA表達(dá)，提示DGKι可能具有某些神經(jīng)元特異性功能。通過(guò)原位雜交分析DGKι在成年大鼠腦中的mRNA定位，發(fā)現(xiàn)其在小腦皮質(zhì)、嗅球和嗅結(jié)節(jié)、海馬神經(jīng)元層高表達(dá)，與先前通過(guò)區(qū)域性Northern免疫印跡分析檢測(cè)到的人腦表達(dá)模式大致相同。此外，在小直徑背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元中也發(fā)現(xiàn)了DGKι高表達(dá)，該處神經(jīng)元主要處理瘙癢和疼痛刺激；而且，DGKι敲除小鼠顯示對(duì)組胺的敏感性增加，表明DGKι參與調(diào)節(jié)對(duì)組胺的感覺(jué)和行為反應(yīng)[26]。DGKι敲除鼠模型的研究顯示，海馬神經(jīng)元中突觸前釋放概率增加，而突觸后代謝型谷氨酸受體依賴性長(zhǎng)時(shí)程抑制(mGluR LTD)作用減弱，提示DGKι的突觸前定位以及DAG信號(hào)的突觸前改變影響突觸后的機(jī)制；進(jìn)一步的行為學(xué)分析表明，DGKι敲除鼠適應(yīng)新環(huán)境需要的時(shí)間更長(zhǎng)，但運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、焦慮行為或空間學(xué)習(xí)和記憶方面無(wú)明顯變化[27]。另一項(xiàng)研究則顯示，DGKι在與DGKβ的協(xié)同作用下共同參與調(diào)節(jié)小鼠的躁狂和焦慮行為，因?yàn)樵贒GKι和DGKβ雙敲除小鼠中觀察到了明顯的焦慮和躁狂表型，而這在上述兩者任何單一的敲除小鼠中均未觀察到[28]。

5 Ⅴ型DGKs(DGKθ)

DGKθ在發(fā)育早期的大腦中表達(dá)顯著，并一直持續(xù)到成年，提示其可能參與大腦發(fā)育。進(jìn)一步對(duì)小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中不同腦區(qū)的定位表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，DGKθ在海馬和小腦皮質(zhì)中呈高表達(dá)，嗅球和腦干核呈中度表達(dá)，并且主要定位于突觸前和突觸后的興奮性神經(jīng)元，在膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量極低[29]。DGKθ敲除小鼠或shRNA干擾DGKθ的小鼠神經(jīng)元與野生小鼠相比，神經(jīng)元經(jīng)過(guò)刺激后的突觸小泡內(nèi)吞速率顯著增加，且隨著刺激程度的增加內(nèi)吞速率進(jìn)一步增加，該效應(yīng)可以通過(guò)野生DGKθ恢復(fù)，突出其在神經(jīng)元刺激中的重要作用[30]。據(jù)此，Barber等[4]提出DGKθ可能參與突觸后AMPA受體內(nèi)吞速率的調(diào)節(jié)，這為認(rèn)識(shí)神經(jīng)突觸可塑性的調(diào)節(jié)提供了一個(gè)新方向。此外，如前所述DGKθ在強(qiáng)烈的神經(jīng)元刺激中發(fā)揮重要作用，那么在神經(jīng)元刺激的病理生理?xiàng)l件下如癲癇疾病模型中研究其特異性抑制劑將是一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，但這需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

綜上所述，目前已知的10種哺乳動(dòng)物DGKs亞型有8種均在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)且顯著高于其他器官中的表達(dá)水平，這些同工酶在結(jié)構(gòu)域上具有共同保守的催化結(jié)構(gòu)域使其能共同參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)DAG和PA水平的平衡，在神經(jīng)系統(tǒng)中與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育以及突觸可塑性等密切相關(guān)。此外，因其蛋白調(diào)控結(jié)構(gòu)域的不同決定了其在神經(jīng)系統(tǒng)中具有不同時(shí)空區(qū)域與亞細(xì)胞定位的表達(dá)模式，并與特定神經(jīng)精神疾病相關(guān)，如DGKβ與BD和癲癇易感性、DGKδ與癲癇、DGKη與BD、DGKε與癲癇易感性和HD、DGKζ與癲癇易感性和惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等。這些研究結(jié)果均提示，DGKs在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的研究?jī)r(jià)值；隨著近年來(lái)對(duì)DGKs的重視與研究深入，其有望成為神經(jīng)系統(tǒng)某些疾病的治療靶點(diǎn)。