任建宇，楊樹法

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京100026

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使產(chǎn)前診斷從傳統(tǒng)的核型分析、FISH檢測(cè)以及QF-PCR等低分辨率、低通量的技術(shù)進(jìn)入到染色體微陣列分析技術(shù)、全基因組測(cè)序以及全外顯子測(cè)序等高分辨率、高通量的檢測(cè)技術(shù)，更多類型的染色體微缺失/重復(fù)、點(diǎn)突變等基因組變異信息被檢出?；诂F(xiàn)有的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，將變異分為致病性、可疑致病性、不確定性、可疑良性以及良性[1～5]。在產(chǎn)前診斷中，致病性不明確變異(包括可疑致病性、不確定性、可疑良性)的檢出率為1%～2%[6]。因此，獲取更多胎兒發(fā)育數(shù)據(jù)協(xié)助臨床醫(yī)生和孕婦判定胎兒發(fā)育情況，具有重要臨床意義。游離RNA反映了來(lái)源細(xì)胞的基因表達(dá)情況[7，8]，羊水游離RNA(AcfRNA)存在于離心后的羊水上清中，是整個(gè)胎兒發(fā)育狀態(tài)的反映。本文將從AcfRNA的來(lái)源和存在形式及影響AcfRNA中基因變化的因素等角度探討羊水游離RNA與胎兒發(fā)育的關(guān)系。

1 AcfRNA的基因來(lái)源與存在形式

1.1 AcfRNA的基因來(lái)源 游離核酸是存在于血液、羊水、尿液以及其他體液中的細(xì)胞外核酸，來(lái)源于凋亡、壞死的細(xì)胞，包括游離DNA和游離RNA。游離DNA反映了來(lái)源細(xì)胞的基因組狀態(tài)，如來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA可用于篩查和診斷腫瘤、預(yù)測(cè)預(yù)后、檢測(cè)耐藥和術(shù)后復(fù)發(fā)等[9～12]。無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查以孕婦血液中胎兒來(lái)源游離DNA(cffDNA)為檢測(cè)對(duì)象，與傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查相比，對(duì)染色體非整倍體具有很高的敏感性和特異性[13]。游離RNA反映了來(lái)源細(xì)胞的基因表達(dá)情況[7，8]，AcfRNA存在于離心后的羊水上清中。

AcfRNA來(lái)源于胎兒細(xì)胞的凋亡和死亡，凋亡細(xì)胞釋放的RNA可以通過胎兒血液經(jīng)由腎臟排泄入羊水，皮膚也是RNA進(jìn)入羊水的重要途徑。研究表明，在孕20周前胎兒皮膚尚未角質(zhì)化，胎兒和羊水間可以通過皮膚進(jìn)行物質(zhì)雙向交換[14]。另外，胎兒吞咽、肺臟分泌以及胎盤擴(kuò)散都也是羊水的來(lái)源[15]，同樣也是AcfRNA的來(lái)源之一。

羊水是產(chǎn)前診斷中最常用的胎兒樣品，也是能夠取到的出生前胎兒最常見的組織或成分。羊水由胎兒脫落細(xì)胞和羊水上清構(gòu)成，脫落細(xì)胞以皮膚細(xì)胞和尿道脫落細(xì)胞為主，而羊水上清來(lái)源更廣泛。在羊水上清中檢測(cè)到的基因種類高于脫落細(xì)胞[16]，神經(jīng)組織特異的基因可以在AcfRNA中檢測(cè)到，卻不能在脫落細(xì)胞中檢測(cè)到。與脫落細(xì)胞相比，AcfRNA更能準(zhǔn)確反映胎兒整體的發(fā)育狀況，用于研究胎兒發(fā)育。

核糖體蛋白、酶類以及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是AcfRNA中最常見的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)是參與細(xì)胞增殖、分化以及凋亡的重要基因[17]。從組織分布來(lái)看，腦、肝臟、腎臟、肺、脊髓、血液、卵巢、上皮、舌、胰腺、腎上腺以及甲狀腺等多個(gè)組織器官的基因均可在AcfRNA中檢測(cè)到[15，17]，這些基因參與骨骼和肌肉系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)等多個(gè)器官系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育。人類胚胎和胎兒組織難以獲得，導(dǎo)致人類胚胎和胎兒組織的轉(zhuǎn)錄組研究較少，尋找其他來(lái)源的胎兒轉(zhuǎn)錄組已成為研究胎兒發(fā)育的重要途徑。AcfRNA的發(fā)現(xiàn)為研究出生前胎兒轉(zhuǎn)錄組提供了很好的材料。

1.2 AcfRNA的存在形式 AcfRNA以不同的形式存在。Larrabee等[18]證實(shí)離心后的羊水上清中含有游離RNA，并用不同孔徑(0.22、0.45、5 μm)的濾膜對(duì)羊水進(jìn)行過濾，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定過濾后的羊水上清中GAPDH和β-globin的含量，發(fā)現(xiàn)過濾能夠顯著降低GAPDH含量，但不能降低β-globin含量，提示游離RNA可能以游離和囊泡形式存在。2017年，Xie等[19]在CD24和CD9雙陽(yáng)性的外泌體中檢測(cè)到游離RNA，證實(shí)了AcfRNA可以囊泡形式存在。AcfRNA包裹囊泡中，從而保證了游離RNA的穩(wěn)定。

2 影響AcfRNA中基因變化的因素

2.1 AcfRNA中的基因成分可隨孕周發(fā)生變化 AcfRNA中基因來(lái)源于發(fā)育中的胎兒，與胎兒器官的發(fā)生密切相關(guān)。胎兒的發(fā)育過程是一個(gè)多器官順序發(fā)育的過程，該過程以組織特異性基因在AcfRNA中變化的形式表現(xiàn)出來(lái)。孕早期，AcfRNA中基因高表達(dá)神經(jīng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)基因；孕中期，AcfRNA中可高表達(dá)基因集中于小腸、胎盤、子宮等組織器官；孕晚期，AcfRNA中高表達(dá)氣管、肺、唾液腺、扁桃體、舌頭、結(jié)腸、骨髓、皮膚等組織器官基因[20，21]。AcfRNA中基因的變化也表現(xiàn)為可變剪接體的變化，隨著孕周增長(zhǎng)，大腦發(fā)育以及免疫相關(guān)通路基因的剪接體表達(dá)量發(fā)生變化。

隨著胚胎的發(fā)育，胎兒皮膚逐漸發(fā)生角質(zhì)化，血腦屏障逐漸形成。AcfRNA中基因的變化受到皮膚角質(zhì)化、血腦屏障發(fā)育等胎兒屏障結(jié)構(gòu)的影響。在脊髓脊膜膨出胎兒，由于血腦屏障發(fā)育缺陷，神經(jīng)發(fā)育和再生相關(guān)基因、脊髓脊膜膨出相關(guān)基因、軸突引導(dǎo)和生長(zhǎng)相關(guān)基因呈高表達(dá)，這些特異表達(dá)在神經(jīng)組織的基因參與了神經(jīng)細(xì)胞遷移、神經(jīng)分化、對(duì)外應(yīng)激、軸突生長(zhǎng)、突觸傳遞以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等多種神經(jīng)功能[22]。

2.2 胎兒發(fā)育異常影響AcfRNA中的基因表達(dá) 胎兒發(fā)育異常表現(xiàn)為相應(yīng)器官和組織中基因表達(dá)變化的差異，進(jìn)而表現(xiàn)為AcfRNA中基因的表達(dá)變化。因此，AcfRNA中基因的變化與胎兒器官發(fā)育異常的機(jī)制密切相關(guān)。

先天性梗阻性腎病可以導(dǎo)致急性或慢性胎兒腎損傷，出現(xiàn)尿道阻塞和腎盂擴(kuò)張，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞死亡。在先天性梗阻性腎病患兒，其胎兒羊水上清外泌體中hsa-miR-299-5p和hsa-miR-300表達(dá)量上調(diào)，二者的靶基因參與Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)通路與腎壞死密切相關(guān)[23]。

胎兒發(fā)育遲緩是指胎兒體質(zhì)量低于其胎齡平均體質(zhì)量的第10百分位，其發(fā)生與孕期中的胎兒、母體以及環(huán)境中的多種因素相關(guān)。當(dāng)胎兒出現(xiàn)發(fā)育遲緩時(shí)，胎兒AcfRNA中與蛋白合成、生物黏附以及胎盤功能相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生變化，生長(zhǎng)和發(fā)育必需的信號(hào)傳導(dǎo)通路受損[24]。

染色體非整倍體是導(dǎo)致胎兒發(fā)育異常的常見原因。21三體和18三體可分別導(dǎo)致唐氏綜合征和愛德華綜合征，這兩種綜合征均存在神經(jīng)發(fā)育異常和智力障礙。在唐氏綜合征和愛德華綜合征患兒，其AcfRNA中神經(jīng)組織特異的基因表達(dá)出現(xiàn)變化，部分發(fā)生變化的基因富集在神經(jīng)疾患相關(guān)通路上，NEUROD2、SOX11等在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用的基因發(fā)生變化[25～27]。先天性卵巢發(fā)育不全癥，又稱為Turner綜合征，是因?yàn)槿鄙僖粭l性染色體導(dǎo)致的。Turner綜合征患兒AcfRNA中XIST基因下調(diào)，并伴有造血和免疫系統(tǒng)相關(guān)基因出現(xiàn)顯著變化[28]。XIST基因是女性體內(nèi)X染色體失活的重要基因，通過X染色體失活保證了女性染色體劑量平衡[29]，與Turner綜合征發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。

在雙胎輸血綜合征患兒以及先兆子癇患兒等妊娠期異常時(shí)，AcfRNA中的基因也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化，這些變化與胎兒的疾病發(fā)生密切相關(guān)[30，31]。在雙胎輸血綜合征患兒AcfRNA中，心血管系統(tǒng)基因表達(dá)異常；在先兆子癇患兒AcfRNA中，細(xì)胞運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)到以及體外應(yīng)激等過程的基因發(fā)生異常表達(dá)。

綜上所述，通過對(duì)孕期不同階段正常胎兒和異常胎兒AcfRNA中基因表達(dá)變化的研究，表明AcfRNA含有來(lái)源于胎兒多個(gè)器官組織的游離RNA，其中某些基因隨孕周和胎兒病理狀態(tài)發(fā)生變化，是胎兒發(fā)育情況的綜合反映。這些變化基因中存在能夠特異性反映胎兒發(fā)育狀態(tài)標(biāo)志性基因，如果能夠篩選出反映不同器官和組織發(fā)育狀態(tài)的關(guān)鍵基因，利用這些基因?qū)μ喊l(fā)育是否異常做出預(yù)測(cè)，具有重要臨床意義。尤其是在面對(duì)產(chǎn)前診斷中可疑性基因突變(拷貝數(shù)變異)時(shí)，將為臨床和孕婦提供重要證據(jù)。