張玨鋒，俞葉飛，李 芳，鐘海英，陳建明，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江大盤山國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理局，浙江 磐安 322300)

絕大多數(shù)昆蟲體內(nèi)都含有共生微生物，尤以半翅目昆蟲更甚，因?yàn)樵撃坷ハx大多以植物汁液為食，吸收的營(yíng)養(yǎng)較為單一，其體內(nèi)的共生微生物有助于寄主的營(yíng)養(yǎng)、發(fā)育、繁殖，以及對(duì)寄主昆蟲天敵的防御[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，共生微生物在昆蟲抵御外界化學(xué)物質(zhì)包括化學(xué)殺蟲劑的降解方面起著重要作用[2]。半翅目的褐飛虱(NilaparvatalugensSt?l，BPH)、白背飛虱(SogatellafurciferaHorvath，WBPH)和灰飛虱(LaodelphaxstriatellaFallén，SBPH)是我國(guó)水稻產(chǎn)區(qū)的主要害蟲，通過取食稻株韌皮部汁液為害；這3種飛虱的暴發(fā)往往具有連續(xù)性，且在取食過程中還會(huì)傳播病毒。目前對(duì)這3種飛虱共生微生物的研究主要集中于其體內(nèi)的共生類酵母在寄主飛虱營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充上的作用[3]。然而，越來(lái)越多的研究表明，昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌類共生微生物有助于宿主的抗藥性發(fā)展[2]、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充[4]和生殖[5]等，該類功能的發(fā)現(xiàn)為害蟲的田間防治提供了新的方向。進(jìn)一步探明昆蟲體內(nèi)細(xì)菌類共生微生物的組成結(jié)構(gòu)，可為害蟲防治新策略的形成提供理論基礎(chǔ)。

體外培養(yǎng)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)和16S rDNA克隆文庫(kù)建立等技術(shù)都曾運(yùn)用于飛虱體內(nèi)細(xì)菌類共生微生物的結(jié)構(gòu)分析，然而以上技術(shù)還不能提供足夠的測(cè)序深度覆蓋飛虱體內(nèi)復(fù)雜的微生物群落。本研究運(yùn)用第二代測(cè)序技術(shù)，以16S rRNA基因作為標(biāo)志物檢測(cè)褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱中腸內(nèi)細(xì)菌群落的組成結(jié)構(gòu)多樣性，比較3種飛虱中腸內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的相似/差異性，以及各個(gè)種群的優(yōu)勢(shì)菌群。本研究可為發(fā)揮共生微生物在飛虱田間防控中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種TN1(Taichung Native)分批分期種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室內(nèi)，至45日齡時(shí)移栽待用。本實(shí)驗(yàn)所用3種飛虱采自杭州郊區(qū)田間，已在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室中飼養(yǎng)50余代，飼養(yǎng)條件：溫度(28±1)℃，光照周期16 h∶8 h(L/D)，初羽化24 h內(nèi)成蟲用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 MiSeq測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程

1.2.1 DNA提取

3種飛虱各取50頭初羽化成蟲，用75%乙醇體表清洗后無(wú)菌條件下解剖出中腸，無(wú)菌水沖洗后-20 ℃保存，用于DNA的提取。細(xì)菌DNA的提取采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(OMEGA，USA)，所得DNA溶于200 μL ddH2O中，用1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 1000分光光度計(jì)(Saveen Werner ApS，丹麥)檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

以純化后的基因組DNA作為模板，以細(xì)菌16S rRNA V1～V3區(qū)特征性引物對(duì)338F、806R擴(kuò)增(338F ：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，同時(shí)在上游引物5′端添加Barcode序列區(qū)分樣品。反應(yīng)體系為5×Fast Pfu緩沖液4.0 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 2 μL、正反向引物(5 μmol L-1)各0.4 μL、Fast Pfu聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng，dd H2O補(bǔ)至20 μL。PCR程序：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個(gè)樣品3次重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3 熒光定量

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.4 Miseq文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序

測(cè)序樣本連接“Y”字形接頭之后使用磁珠篩選，去除接頭自連片段，利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫(kù)模板的富集，NaOH變性產(chǎn)生單鏈DNA片段。將DNA片段的一端與引物堿基互補(bǔ)，固定在芯片上；另一端隨機(jī)與附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，形成“橋(bridge)”；PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生DNA簇；DNA擴(kuò)增子線性化成為單鏈。加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP，每次循環(huán)只合成1個(gè)堿基；用激光掃描反應(yīng)板表面，讀取每條模板序列第一輪反應(yīng)所聚合上去的核苷酸種類；將“熒光基團(tuán)”和“終止基團(tuán)”化學(xué)切割，恢復(fù)3′端黏性，繼續(xù)聚合第2個(gè)核苷酸。統(tǒng)計(jì)每輪收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲取模板DNA片段的序列。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

生物信息分析方法使用mothur軟件完成。有效序列數(shù)據(jù)分析：通過Barcode區(qū)分各樣品的測(cè)序數(shù)據(jù)，生成不含Barcode的各樣品測(cè)序序列。

優(yōu)化數(shù)據(jù)分析：Miseq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)的reads拼接成一條序列，同時(shí)對(duì)reads的質(zhì)量和拼接效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，過濾read尾部質(zhì)量值<20的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質(zhì)控50 bp以下的read；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接成1條序列，最小overlap長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列，根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列，并校正序列方向。

操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)聚類分析：使用Vsearch(版本2.4.2)軟件對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按照序列97%相似度進(jìn)行OTU分類，選取每個(gè)OTU中豐度最大的序列作為該OTU的代表序列，采用貝葉斯分類算法對(duì)代表序列與Silva、Greengenes、Rdp數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)注釋，得到OTU的注釋信息，根據(jù)每個(gè)OTU在各個(gè)樣本中包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各個(gè)樣本中的豐度矩陣文件，根據(jù)序列比對(duì)采用Pynast (v0.1)軟件對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的構(gòu)建。

稀釋性曲線：使用97%序列相似度的OTU，利用mothur做rarefaction分析，利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖。

群落結(jié)構(gòu)組分圖：利用R語(yǔ)言工具作圖，并在作圖時(shí)將豐度低于1%的部分合并為other在圖中顯示。

熱圖：利用R語(yǔ)言vegan包、vegdist和hclust進(jìn)行距離計(jì)算和聚類分析。距離算法采用Bray-Curtis，聚類方法選用complete。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)優(yōu)化與統(tǒng)計(jì)

本次測(cè)序中，3種飛虱9個(gè)樣本共獲得2.62×108bp的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過以上處理后3種飛虱(9個(gè)樣本)共得到3.44×105條序列，平均長(zhǎng)度為447.78 bp，其中401～500 bp的片段占總片段的99.99%。從表1可知，灰飛虱(SBPH)獲得的有效序列和堿基數(shù)明顯多于褐飛虱(BPH)和白背飛虱(WBPH)，但3種飛虱序列的平均長(zhǎng)度并無(wú)顯著差異。

2.2 三種飛虱細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)通常用于估計(jì)環(huán)境群落微生物的豐度和多樣性。Chao指數(shù)是用算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，Ace指數(shù)也是用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，與Chao指數(shù)的算法不同。Shannon與Simpson指數(shù)是用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)，Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高，Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。Coverage指數(shù)是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒有被測(cè)出的概率越低。本實(shí)驗(yàn)在3%和6%水平比較各個(gè)樣品的指數(shù)，結(jié)果(表2)表明：白背飛虱(WBPH)的OTU數(shù)量最多；灰飛虱最少，其在3%和6%水平分別為白背飛虱的59.22%和61.76%。表2中Shannon多樣性指數(shù)顯示，白背飛虱在3種飛虱中具有最高的細(xì)菌群落多樣性。圖1的稀釋性曲線也表明，3%水平的褐飛虱和灰飛虱的細(xì)菌群落多樣性顯著低于白背飛虱。同時(shí)，圖1顯示本次測(cè)序的3個(gè)樣本在測(cè)序深度為112 189時(shí)趨于平穩(wěn)，表明該測(cè)序深度足以覆蓋3個(gè)稻飛虱種群的整個(gè)細(xì)菌多樣性。

2.3 OTUs統(tǒng)計(jì)與分類學(xué)分析

采用RDPclassifier貝葉斯算法對(duì)OUT代表序列進(jìn)行比對(duì)分析，3種飛虱中腸細(xì)菌類微生物共聚類于11個(gè)門20個(gè)綱35個(gè)目54個(gè)科81個(gè)屬。運(yùn)用BLAST和MEGAN軟件對(duì)3個(gè)飛虱樣本有效序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果(圖2)顯示，灰飛虱中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與其他2個(gè)飛虱樣本存在明顯差異，近90%的序列比對(duì)后歸于F-proteobacteria-unclassified；而在其他2個(gè)飛虱種群內(nèi)，Arsenophonus為褐飛虱(BPH)中腸細(xì)菌群落優(yōu)勢(shì)菌屬，約占70%；白背飛虱(WBPH)中Halomonas、Candidatus_Cardinium和Arsenophonus為優(yōu)勢(shì)菌，分別約占35%、20%和15%。本研究中，褐飛虱、白背飛虱和灰飛虱中腸樣本中鑒定出的細(xì)菌分別有57、76和48個(gè)屬，說(shuō)明灰飛虱和褐飛虱中腸細(xì)菌群落多樣性在屬水平明顯低于白背飛虱。

表1 三種飛虱基因序列參數(shù)比較

表2 三種飛虱種群中腸細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)比較

圖中1，2，3表示每種飛虱的生物學(xué)重復(fù)數(shù)。The number 1， 2 and 3 represent biological duplications of each planthopper species.圖1 三種飛虱在3%水平的稀釋性曲線Fig.1 Rarefaction curves of three samples at cutoff levels of 3 %

由圖3可知：3種飛虱中腸內(nèi)相對(duì)豐度最高的10種細(xì)菌類微生物中，Halomonas是唯一一種在褐飛虱、灰飛虱和白背飛虱體內(nèi)均檢測(cè)到的屬，且Halomonas在白背飛虱體內(nèi)具有最高相對(duì)豐度；同時(shí)，灰飛虱和白背飛虱中腸都檢測(cè)到Wolbachia；褐飛虱和白背飛虱中腸均檢測(cè)到Pantoea。該結(jié)果也說(shuō)明3種飛虱中腸優(yōu)勢(shì)細(xì)菌較少存在相互交叉的種類。

從圖3還可以看出，3種飛虱體內(nèi)各優(yōu)勢(shì)菌的相對(duì)豐度存在差異，如灰飛虱中腸內(nèi)，雖然Wolbachia為第2大優(yōu)勢(shì)菌，但其相對(duì)含量與γ-proteobacteria-unclassified相差甚遠(yuǎn)。相同的現(xiàn)象在褐飛虱體內(nèi)也存在，優(yōu)勢(shì)菌Arsenophonus與Acinetobacter在含量百分比上相距甚遠(yuǎn)。與前兩者不同的是，白背飛虱(WBPH)中腸內(nèi)前3種優(yōu)勢(shì)菌Halomonas、CandidatusCardinium與Acinetobacter的相對(duì)含量百分比較為接近。推測(cè)，雖然3種飛虱中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多樣性高，但從優(yōu)勢(shì)細(xì)菌相對(duì)豐度而言，體內(nèi)占主導(dǎo)地位的微生物不易受外界因子的影響。

Gammaproteobacteria-unclassified，γ-變形菌綱(未確定)；Arsenophonus，殺雄菌屬；Halomonas，鹽單胞菌屬；Acinetobacter，不動(dòng)桿菌屬；Candidatus_Cardinium，Caidinium屬；Wolbachia，沃巴克氏體；Aeromonas，氣單胞屬；Serratia，沙雷氏菌；Pelagibacterium，海洋桿菌屬；Aliihoeflea，化能自養(yǎng)砷氧化菌；Pantoea，泛菌屬；Sphingobacterium，鞘氨醇桿菌屬；Stenotrophomonas，寡養(yǎng)單胞菌；Rickettsia，立克次氏體；Herbaspirillum，草螺菌屬；Phyllobacteriaceaen，葉瘤桿菌科；Massilia，馬賽菌屬；Pseudomonas，假單胞菌菌；Sphingobacterium，鞘氨醇桿菌屬；Others，其他。圖2 不同飛虱中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Bacterial community structure of midgut in three different planthoppers

Arsenophonus，殺雄菌屬；Acinetobacter，不動(dòng)桿菌屬；Serratia，沙雷氏菌；Sphingobacterium，鞘氨醇桿菌屬；Stenotrophomonas，寡養(yǎng)單胞菌；Pantoea，泛菌屬；Enterobacteriaceae_Unclassified，腸桿菌科(未確定)；Leucobacter，白色桿菌屬；Halomonas，鹽單胞菌屬；Pseudoclavibacter，假棒狀桿菌屬；Gammaproteobacteria-unclassified，γ-變形菌綱(未確定)；Wolbachia，沃巴克氏體；Rickettsia，立克次氏體；Herbaspirillum，草螺菌屬；Staphylococcus，葡萄球菌屬；Kocuria，考克氏菌屬；Yersinia，耶爾森菌屬；Corynebacterium，棒桿菌屬；Candidatus_Cardinium，Caidinium屬；Acinetobacter，不動(dòng)桿菌屬；Aeromonas，氣單胞菌屬；Pelagibacterium，海洋桿菌屬；Aliihoeflea，化能自養(yǎng)砷氧化菌；Phyllobacteriaceae_Unclassified，葉桿菌科(未確定)；Massilia，馬賽菌屬。圖3 三種飛虱中腸內(nèi)主要細(xì)菌種類的相對(duì)含量Fig.3 Comparison of relative contents of main bacterias in three planthopper species

2.4 三種飛虱中腸細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

PCA是基于歐式距離分析不同飛虱種群中腸微生物的OTU組成，反映不同種類飛虱體內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)變化差異和距離。挑選不同種群的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類進(jìn)行作圖，結(jié)果如圖4所示，主成分PC1、PC2累積貢獻(xiàn)率為98.01%，基本可反映樣本間種群結(jié)構(gòu)差異的影響因素。各個(gè)樣本基于不同距離在PC1和PC2方向上可以較好地分開，3種飛虱的各個(gè)重復(fù)之間距離較近，但3種不同飛虱之間相互距離較遠(yuǎn)；其中，褐飛虱與白背飛虱中腸細(xì)菌類微生物組成的相似性要高于灰飛虱。

圖4 三種飛虱體內(nèi)細(xì)菌類微生物群落結(jié)構(gòu)主成分分析Fig.4 Principal component analysis of microbial community structure in three planthoppers

3 討論

3種飛虱中腸細(xì)菌類微生物群落結(jié)構(gòu)、群落豐富度和優(yōu)勢(shì)微生物功能側(cè)重等都存在差異。豐富度曲線顯示白背飛虱體內(nèi)中腸細(xì)菌的豐富度高于褐飛虱和灰飛虱。3個(gè)飛虱種群體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類微生物主要屬于7個(gè)大綱(γ-proteobacteria、α-proteobacteria、β-proteobacteria、Bacillus、Actinobacteria、Cytophagia、Sphingobacteriia)21個(gè)屬。就10種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌而言，3個(gè)飛虱種群體內(nèi)的腸道細(xì)菌類微生物類群差異較大，在3個(gè)種群中都存在的細(xì)菌屬僅有Halomonas，并且除該菌之外，每2個(gè)飛虱種群之間也僅有1種共有優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。此次在3種飛虱中檢測(cè)到的21種共生腸道細(xì)菌類微生物，包括Wolbachia、Arsenophonus等12個(gè)屬此前已在飛虱中有過報(bào)道[6-8]，Kocuria、Yersinia等9個(gè)屬此前在飛虱微生物中未見報(bào)道。雖然3種飛虱起源于同一祖先，但在各自進(jìn)化過程中，生活習(xí)性、寄主選擇等存在差異，造成為害時(shí)間、為害部位，以及遷飛、越冬方式等都存在差異[9]。如褐飛虱僅能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代，灰飛虱和白背飛虱的寄主除水稻外還包括禾本科其他作物，如小麥、玉米等。相輝等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，食料的變化會(huì)影響家蠶體內(nèi)腸球菌的組成，因而推測(cè)3種飛虱的取食差異有可能與中腸細(xì)菌類微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異有關(guān)。而共生細(xì)菌在寄主對(duì)植物的適合度、寄主昆蟲的競(jìng)爭(zhēng)能力和對(duì)寄主植物的利用能力等方面具有重要作用[11-12]。3種飛虱中灰飛虱耐低溫能力較強(qiáng)，即使在冬季低溫亦能安全越冬，而褐飛虱與白背飛虱屬長(zhǎng)距離遷飛性害蟲，無(wú)法在寒冷地區(qū)越冬，初次蟲源由南方熱帶稻區(qū)隨氣流逐代逐區(qū)遷入。已有研究表明，被冰核活性細(xì)菌Erwinia(Pantoea)ananas定植于腸道的桑螟幼蟲(Mulberrypyralid)抗寒性大大降低，說(shuō)明中腸細(xì)菌類微生物與寄主的耐寒、耐熱性等有關(guān)[13]。同時(shí)，褐飛虱在抗性水稻品種的誘導(dǎo)下易發(fā)生致害性變異。徐紅星等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，取食感蟲水稻品種的褐飛虱種群體內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯與取食抗蟲品種的褐飛虱種群體內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在差異。而灰飛虱、白背飛虱種群中并不存在致害性變異的現(xiàn)象，推測(cè)該現(xiàn)象的存在與3種飛虱中腸細(xì)菌類微生物群落結(jié)構(gòu)差異有關(guān)。

除結(jié)構(gòu)與豐富度的差異之外，3種飛虱體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌在功能上各有側(cè)重。Wolbachia、Arsenophonu與CandidatusCardinium與昆蟲的生殖抑制現(xiàn)象有關(guān)，此次測(cè)序結(jié)果顯示僅白背飛虱體內(nèi)這3種菌都檢測(cè)到，該結(jié)果與張開軍[15]的研究結(jié)果一致。灰飛虱體內(nèi)僅檢測(cè)到Wolbachia，褐飛虱體內(nèi)僅檢測(cè)到Arsenophonus。研究表明，灰飛虱和白背飛虱體內(nèi)的Wolbachia能引起寄主的胞質(zhì)不親和(CI)現(xiàn)象[16]，褐飛虱體內(nèi)的Wolbachia與前兩者屬不同類，并不能引起寄主的CI現(xiàn)象，也沒有研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱存在CI現(xiàn)象。此次檢測(cè)未在褐飛虱體內(nèi)檢測(cè)到Wolbachia，這可能與本次檢測(cè)用的褐飛虱種群為杭州種群有關(guān)。屈呂宇等[17]對(duì)采自褐飛虱主要分布區(qū)的不同地理種群Wolbachia感染情況進(jìn)行qPCR檢測(cè)，也未在杭州種群體內(nèi)檢測(cè)出Wolbachia。Nakamura等[18]的研究表明，CandidatusCardinium與Wolbachia同時(shí)存在時(shí)可提高后者的CI效率；Skinner[19]與Gherna等[20]研究表明，麗蠅金小蜂體內(nèi)的Arsenophonus可以引起雄性胚胎致死，致使宿主后代性別趨向雌性，雖然該功能未在其他昆蟲體內(nèi)得到驗(yàn)證，但繁殖力較弱的B型煙粉虱種群ZHJ21體內(nèi)能檢測(cè)出Wolbachia與Arsenophonus，而繁殖力強(qiáng)的B型煙粉虱則不攜帶[21]，可推測(cè)Wolbachia與Arsenophonus的同時(shí)存在能影響寄主的繁殖。綜上，可推測(cè)白背飛虱體內(nèi)存在的可能對(duì)寄主生殖產(chǎn)生影響的細(xì)菌類微生物種類較多，灰飛虱次之，而褐飛虱體內(nèi)僅檢測(cè)到Arsenophonus，何種原因造成該類微生物在3種飛虱體內(nèi)的分布差異，以及該類細(xì)菌如何對(duì)寄主生殖進(jìn)行調(diào)控還需進(jìn)一步研究。

昆蟲體內(nèi)的腸道微生物通常具有降解外源有毒化學(xué)物質(zhì)的功能。此次在3種飛虱中檢測(cè)到了Halomonas、Acinetobacter、Aliihoeflea、Stenotrophomonas和Sphingobacterium。其中，Halomonas屬的微生物具有很強(qiáng)的生存適應(yīng)能力，在低于1 100 mg·L-1苯酚中能正常生長(zhǎng)[22]。Acinetobacter在白背飛虱與褐飛虱體內(nèi)都檢測(cè)到，Wang等[6]發(fā)現(xiàn)，該菌與寄主褐飛虱致害性轉(zhuǎn)變存在關(guān)聯(lián)，但對(duì)該菌的進(jìn)一步分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Acinetobacter為氟蟲睛的降解菌，能夠在以該殺蟲劑為唯一碳源的培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。存在于白背飛虱體內(nèi)的Aliihoeflea是一種對(duì)亞砷酸鹽有降解作用的微生物，有研究在Aliihoeflea中檢測(cè)到亞砷酸鹽氧化酶基因[23]。Stenotrophomonas與Sphingobacterium僅在褐飛虱體內(nèi)有檢測(cè)到，此前研究發(fā)現(xiàn)該屬中的一株從土壤中篩選分離并進(jìn)行培養(yǎng)的微生物具有將煙堿吡蟲啉高效羥基化合成5-羥基煙堿吡蟲啉的功能[24-25]。而同樣從土壤中分離的Sphingobacteriumsp. P1-3具有降解等規(guī)聚丙烯(IPP)的功能，在30 ℃、pH 7.0和10 mg·L-1IPP條件下，Sphingobacteriumsp. P1-3在20、30 d內(nèi)對(duì)IPP的降解度可達(dá)57.75%和62.47%。褐飛虱與白背飛虱體內(nèi)存在多種可能與化學(xué)殺蟲劑降解有關(guān)的腸道微生物，特別是褐飛虱體內(nèi)存在可能與降解氟蟲睛、新堿類殺蟲劑殺蟲劑(吡蟲啉、哌蟲啶)有關(guān)的微生物，這可能與我國(guó)自20世紀(jì)90年代開始大面積使用新煙堿類殺蟲劑，如吡蟲啉、噻蟲嗪、烯啶蟲胺、呋蟲胺等[26]，而田間白背飛虱和褐飛虱發(fā)生時(shí)間重疊，通常采用相似的防控手段有關(guān)。推測(cè)外界化學(xué)物質(zhì)的使用影響昆蟲腸道菌的菌群結(jié)構(gòu)變化，而腸道微生物的變化又可能誘導(dǎo)寄主對(duì)化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗性。

除了與生殖和外源化學(xué)物質(zhì)降解有關(guān)的微生物之外，3種飛虱體內(nèi)還存在多種目前無(wú)法確定其功能的優(yōu)勢(shì)菌。Herbaspirillum[27]、Pelagibacterium[28]、Leucobacter[29]、Pseudoclavibacter、Staphylococcus[30]通常存在于周圍環(huán)境中，包括土壤、水、皮膚，本研究首次在飛虱體內(nèi)檢測(cè)到，該類微生物是在蟲體在進(jìn)化過程中定殖于寄主體內(nèi)，還是在實(shí)驗(yàn)操作過程中不慎帶入還需進(jìn)一步研究。Pantoea是一種對(duì)植物有益的微生物，在楊樹、水稻中都有發(fā)現(xiàn)[31]。以上結(jié)果說(shuō)明，在昆蟲的進(jìn)化過程中，環(huán)境中的微生物極其容易被昆蟲攝入并在其體內(nèi)定殖。Rickettsia和Yersinia都為病原菌，前者可以顯著提高煙粉虱(Bemisiatabaci)后代性比，還能提高雌蟲產(chǎn)卵量、后代羽化率和成蟲壽命等[32]；后者會(huì)引起男性腸炎，本研究首次在飛虱中檢測(cè)到。但是該屬中的Yersiniaenterocolitica在近期研究中被證明對(duì)昆蟲有毒害作用，因該菌可編碼殺蟲毒素和其他毒力因子[33]。但Rickettsia和Yersinia在飛虱中的功能還無(wú)法確定。Corynebacterium是以昆蟲為媒介傳播的病原菌，該屬中的Corynebacteriumpseudotuberculosis可通過蠅類傳播給馬，但未見在其他昆蟲中報(bào)道[34]。Aeromonas、Massilia和Serratia都已在褐飛虱體內(nèi)檢測(cè)到[6-8]，其中，Massilia在二化螟幼蟲的腸道中也能檢測(cè)到[35]，目前僅可推測(cè)這2種菌均為腸道菌，而Serratia可能與褐飛虱的致害性轉(zhuǎn)變存在關(guān)聯(lián)[6]。Kocuria是首次在飛虱體內(nèi)檢測(cè)到的微生物，該屬具有很好的腐殖質(zhì)還原特性，對(duì)生物染料包括孔雀石綠、棉蘭、甲基橙等具有脫色作用[36]，但無(wú)法推測(cè)在飛虱體內(nèi)的功能。

半翅目昆蟲體內(nèi)共生微生物的研究主要集中于對(duì)寄主營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充方面，而本次測(cè)序結(jié)果顯示，3種飛虱體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌株中存在多種與寄主生殖控制、殺蟲劑降解功能有關(guān)的微生物。以本研究提供的信息為基礎(chǔ)，結(jié)合飛虱體內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可為褐飛虱的田間防控提供新的思路。