唐 標(biāo)，陳凌云，羅 怡，3，施杏芬，胡 驥，陳怡飛，錢鳴蓉，楊 華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(籌)，浙江 杭州 310021； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.中國計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018； 4.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 310020)

沙門氏菌(Salmonella)和彎曲桿菌(Campylobacter)是最常見的2類食源性致病菌，可引起腹瀉、菌血癥等多種嚴(yán)重危害人體健康的感染性疾病[1-3]。近年來，抗生素因其有效的促生長和預(yù)防疾病的作用在畜禽養(yǎng)殖中得到了大量使用，但也引發(fā)了嚴(yán)重的動(dòng)物源和食源性的細(xì)菌耐藥性問題[4-5]。沙門氏菌和彎曲桿菌是動(dòng)物腸道中的常見致病菌，耐藥菌株可以在養(yǎng)殖場傳播給養(yǎng)殖從業(yè)人員，同時(shí)通過屠宰、運(yùn)輸和銷售環(huán)節(jié)傳播給消費(fèi)者。作為耐藥基因儲(chǔ)藏庫，耐藥菌株攜帶的多種獲得性耐藥基因能夠通過水平轉(zhuǎn)移途徑(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座元件等)向人、環(huán)境傳播擴(kuò)散，從而加速細(xì)菌耐藥性水平的提高[6-8]。食源性致病菌的源頭可追溯至養(yǎng)殖動(dòng)物，耐藥性問題現(xiàn)已成為控制畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的新課題。據(jù)Zhang等[9]的報(bào)道，2008—2012年在上海和河南分離的145株鼠傷寒沙門氏菌對頭孢噻呋、氨芐西林、四環(huán)素、慶大霉素、復(fù)方新諾明的耐藥性分別是49.0%、47.6%、45.5%、35.2%、32.4%，77.2%的鼠傷寒沙門氏菌對至少3種抗生素耐藥；Jiang等[10]報(bào)道，2017年在河南省豬場分離的沙門氏菌，主要血清型為鼠傷寒和德爾卑，對環(huán)丙沙星、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑和氨芐西林的耐藥率均超過80%。彎曲桿菌近年來的耐藥率同樣較高，據(jù)Zhang等[11]報(bào)道，華南地區(qū)2017—2019年從禽肉和人上分離的彎曲桿菌對萘啶酸、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、氟苯尼考的耐藥率分別是91.9%、88.5%、87.2%、46.6%。如上所述，動(dòng)物源細(xì)菌在不同時(shí)間、不同地區(qū)的耐藥性均已處于較高水平，但其具體表現(xiàn)也存在一定的差異；因此，對上述2類病原菌的耐藥性水平進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測非常必要。

本研究在浙江省和福建省的養(yǎng)殖場、禽交易市場采集糞便、肛拭子樣品，分離沙門氏菌和彎曲桿菌，隨后進(jìn)行血清型分型、藥敏試驗(yàn)，獲得其耐藥性特征，以期為當(dāng)?shù)氐墓残l(wèi)生安全和動(dòng)物源細(xì)菌耐藥水平控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

2019年7—11月，在浙江省寧波、嘉興、金華、溫州、紹興5市的8個(gè)雞養(yǎng)殖場和禽交易市場、2個(gè)鴨場、2個(gè)豬場隨機(jī)采集新鮮畜禽糞便和肛拭子樣品共計(jì)1 000份，在福建省福州、南平、廈門、莆田、漳州5市的6個(gè)雞場、1個(gè)鴨場、4個(gè)豬場采集糞便和肛拭子樣品共計(jì)480份。采集的樣品均來源于健康動(dòng)物。樣品采集后置于低溫(2～8 ℃)采樣箱中，當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行沙門氏菌和彎曲桿菌分離前的處理工作。

1.2 主要試劑

LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、緩沖蛋白胨水(BPW)、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)、Swarm瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；沙門氏菌、彎曲桿菌顯色培養(yǎng)基，購自法國科瑪嘉(Chromagar)；HCCA基質(zhì)溶液，購自德國布魯克(Bruker)公司；Premix PrimeSTAR HS試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，購自上海捷瑞生物工程有限公司；沙門氏菌診斷血清，購自丹麥SSI公司；藥敏檢測板，購自上海星佰生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 沙門氏菌和彎曲桿菌分離培養(yǎng)

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016和GB 4789.9—2014分別進(jìn)行沙門氏菌和彎曲桿菌的分離培養(yǎng)。刮取純化后的菌落保存在25%(體積分?jǐn)?shù))甘油凍存管中，保藏于-80 ℃冰箱。

1.3.2 菌株鑒定

將1.3.1節(jié)分離到的疑似菌株接種劃線至LB瓊脂培養(yǎng)基上，(36±1)℃條件下培養(yǎng)16～24 h，隨后使用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)方法對沙門氏菌和彎曲桿菌進(jìn)行鑒定：使用無菌牙簽挑取疑似單菌落于靶板孔中，涂抹均勻后滴加1 μL的70%(體積分?jǐn)?shù))甲酸，室溫條件下自然風(fēng)干10 min，隨后滴加1 μL HCCA基質(zhì)溶液，室溫干燥10 min。使用MALDI Biotyper RTC軟件[12]進(jìn)行數(shù)據(jù)自動(dòng)采集與分析。

1.3.3 沙門氏菌血清分型

將待測沙門氏菌劃線至LB瓊脂培養(yǎng)基上，(36±1)℃條件下培養(yǎng)16～18 h。滴加適量O價(jià)血清于透明平皿上，隨后使用無菌牙簽挑取適量菌體于O價(jià)血清上，涂抹均勻，10～30 s后觀察凝集反應(yīng)，記錄發(fā)生凝集反應(yīng)的O價(jià)血清類別。挑取LB瓊脂培養(yǎng)基上的沙門氏菌單菌落，在Swarm瓊脂培養(yǎng)基的中心位置轉(zhuǎn)接，(36±1)℃條件下培養(yǎng)16～18 h，挑取菌落邊緣適量菌體于H價(jià)血清上，記錄發(fā)生凝集反應(yīng)的H價(jià)血清類別。最后對照Kauffman-White沙門氏菌診斷抗原表，查詢最終血清型。

1.3.4 藥物敏感性試驗(yàn)

參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S25文件推薦的微量肉湯稀釋法，使用藥敏檢測板測定沙門氏菌分離株對16種常見抗生素——氨芐西林(AMP)、奧格門丁(A/C)、慶大霉素(GEN)、大觀霉素(SPT)、四環(huán)素(TET)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異惡唑(SF)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)和乙酰甲喹(MEQ)的藥敏表型，檢測彎曲桿菌對9種抗生素——阿奇霉素(AZM)、環(huán)丙沙星(CIP)、紅霉素(ERY)、慶大霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、萘啶酸(NAL)、泰利霉素(TEL)和克林霉素(CLI)的藥物敏感性。質(zhì)控菌株分別為大腸埃希菌ATCC 25922和空腸彎曲桿菌ATCC 33560。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門氏菌和彎曲桿菌的分離情況

在浙江省采集的1 000份樣品中分離到沙門氏菌56株，在福建省采集的480份樣品中分離到沙門氏菌44株。所有沙門氏菌均通過MALDI-TOF-MS和血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行了確認(rèn)。在合計(jì)分離到的100株沙門氏菌中，共有94株確定了血清型(另有6株未鑒定出)，包括策維埃(19株)、肯塔基(15株)、韋太夫雷登(15株)、鼠傷寒(14株)、腸炎(14株)、阿貢納(6株)、羅森(5株)、Ⅱ(2株)、查理(2株)、圖莫迪(1株)和埃森(1株)11種血清型，其中以策維埃血清型分布最廣(圖1)。

圖1 分離到的沙門氏菌的血清型分布Fig.1 Serotype distribution of isolated Salmonella strains

在采集的樣品中共計(jì)分離到100株彎曲桿菌，其中，分離自浙江樣品的有82株，分離自福建樣品的有18株，均通過MALDI-TOF-MS進(jìn)行了驗(yàn)證。

2.2 沙門氏菌和彎曲桿菌的耐藥情況

就分離的100株沙門氏菌對16種抗生素的耐藥性進(jìn)行了最小抑菌濃度(MIC)檢測，其中，安普霉素和乙酰甲喹由于未定義折點(diǎn)，暫未統(tǒng)計(jì)。分離到的沙門氏菌對14種抗生素的耐藥率分別為氨芐西林70%、奧格門丁6%、慶大霉素42%、大觀霉素44%、四環(huán)素76%、氟苯尼考58%、磺胺異惡唑65%、復(fù)方新諾明53%、頭孢噻呋23%、頭孢他啶19%、恩諾沙星24%、氧氟沙星20%、美羅培南0、黏菌素12%。耐藥率最高的3種抗生素分別為四環(huán)素、氨芐西林和磺胺異惡唑，均大于60%(圖2-A)。根據(jù)測得的MIC分布規(guī)律來看，沙門氏菌對大部分抗生素的MIC分布較廣，耐藥和敏感MIC邊界明顯。其中，有超過30%的菌株對氨芐西林、大觀霉素、氟苯尼考、磺胺異惡唑等的MIC大于256，表現(xiàn)出很高的耐藥水平(圖3)。沙門氏菌對奧格門丁的耐藥率較低；對美羅培南則全部敏感，MIC≤0.03；對黏菌素的MIC值連續(xù)，在0.25～4。

圖2 分離到的沙門氏菌(A)和彎曲桿菌(B)的耐藥率Fig.2 Antimicrobial resistance rates of isolated Salmonella(A) and Campylobacter(B) strains

100株彎曲桿菌對9種抗生素的耐藥率分別為環(huán)丙沙星99%、萘啶酸88%、慶大霉素23%、四環(huán)素87%、克林霉素63%、紅霉素43%、阿奇霉素58%、泰利霉素42%、氟苯尼考29%。其中，對慶大霉素的耐藥率最低，而對環(huán)丙沙星、萘啶酸和四環(huán)素的耐藥率均超過80%(圖2-B)。供試的對慶大霉素、四環(huán)素、克林霉素、紅霉素、阿奇霉素耐藥的菌株中，大部分的MIC均超出試劑盒的測定范圍(圖4)。

2.3 多重耐藥分析

分離到的100株沙門氏菌中，有15株對測定的所有抗生素均敏感，其余85株菌的耐藥表型有28種，其中，以AMP-GEN-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL的耐藥表型占比最高，共有18株菌，其次是AMP-SPT-TET-FFC-SF-SXT，共有8株菌，說明沙門氏菌的多重耐藥現(xiàn)象較為普遍(表1)。

表1 分離到的沙門氏菌的耐藥譜

分離到的彎曲桿菌中僅有1株菌對測試的9種抗生素全部敏感，其余菌株共有25種耐藥表型。其中，CIP-NAL-TET耐藥表型的比例為21%，與環(huán)丙沙星、萘啶酸和四環(huán)素是彎曲桿菌耐藥率前3的抗生素排名相吻合。CIP-NAL-TET-CLI-ERY-AZM-TEL、CIP-TET-CLI-ERY-AZM-FFC表型的占比均為11%。從耐藥譜可以看出，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素——紅霉素、克林霉素、阿奇霉素的耐藥相關(guān)性高，喹諾酮類抗生素——環(huán)丙沙星、萘啶酸的耐藥表型大都同時(shí)出現(xiàn)，表現(xiàn)出菌株對同類藥物的交叉抗性。對比發(fā)現(xiàn)，彎曲桿菌相比沙門氏菌對已檢測的抗生素的耐藥水平更高，且同樣表現(xiàn)出了高水平的多重耐藥特征。

圖3 分離到的沙門氏菌對16種抗生素的MIC分布Fig.3 MIC distributions of isoltaed Salmonella strains to 16 antibiotics

圖4 分離到的彎曲桿菌對9種抗生素的MIC分布Fig.4 MIC distributions of isolated Campylobacter strains to 9 antibiotics

表2 分離到的彎曲桿菌的耐藥譜

3 結(jié)論與討論

沙門氏菌是國內(nèi)重點(diǎn)關(guān)注的食源性致病菌，也是流行性規(guī)律研究相對較多的病原菌。本研究于2019年從浙江和福建2省分離動(dòng)物源沙門氏菌共計(jì)100株，其中94株沙門氏菌的血清型被鑒定出來。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，流行性最廣的5種血清型分別為策維埃、肯塔基、韋太夫雷登、鼠傷寒、腸炎，這與Tang等[13]報(bào)道的2018年印第安納、鼠傷寒、腸炎為主要流行血清型的結(jié)果不一致。本研究并未分離出印第安納這一常見血清型[14-15]，說明動(dòng)物源沙門氏菌的流行性在動(dòng)態(tài)變化，采樣地點(diǎn)、采樣時(shí)間和樣本量的差異都會(huì)造成研究結(jié)果的差異。因此，沙門氏菌在畜禽養(yǎng)殖中的常規(guī)化監(jiān)測仍須持續(xù)進(jìn)行。

本文進(jìn)一步對分離到的沙門氏菌和彎曲桿菌的耐藥性進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。動(dòng)物源致病菌的耐藥性是近年來的研究熱點(diǎn)，據(jù)報(bào)道，其耐藥性與獸用抗生素的使用情況呈正相關(guān)[16]。四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類和青霉素類均是畜禽養(yǎng)殖過程中飼料添加和治療使用的常用藥物[17-19]。本研究通過對沙門氏菌進(jìn)行16種藥物、對彎曲桿菌進(jìn)行9種藥物的MIC測定發(fā)現(xiàn)，分離到的沙門氏菌對四環(huán)素、氨芐西林和磺胺異惡唑的耐藥率最高達(dá)76%，分離到的彎曲桿菌對環(huán)丙沙星、萘啶酸和四環(huán)素的耐藥率最高可達(dá)99%。美羅培南是臨床治療革蘭氏陰性菌感染使用的碳青霉烯類藥物[20]，在動(dòng)物養(yǎng)殖中禁用，所以在動(dòng)物中的耐藥菌檢出率遠(yuǎn)低于人。本研究在100株沙門氏菌中未發(fā)現(xiàn)美羅培南耐藥菌株，符合預(yù)期。然而，這并不代表畜禽養(yǎng)殖過程中不存在美羅培南的耐藥菌株。根據(jù)先前研究，通過篩選仍能獲得美羅培南耐藥菌株[21]。另外，黏菌素作為促生長藥物長期在飼料中添加，且用量較大，但于2017年被禁止在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[22]。新近的報(bào)道指出，2019年大腸埃希菌對黏菌素的耐藥率下降[23]。然而，本研究中分離到的沙門氏菌對黏菌素耐藥的比例仍超過10%，說明細(xì)菌耐藥性的下降趨勢在不同菌種里稍有不同，控制動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥水平是一個(gè)長期的過程。

總體來說，本研究中的沙門氏菌和彎曲桿菌耐藥性水平高，多重耐藥性非常普遍，其中，沙門氏菌最高抗11種藥物，且占比18%。造成這一現(xiàn)象的原因，從根本上說是多種藥物共同選擇的結(jié)果，而后，多種獲得性耐藥基因極有可能通過質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座元件介導(dǎo)，整合在菌株基因組或質(zhì)粒上[7，24-25]。因此，多重耐藥菌的傳播會(huì)使得對細(xì)菌耐藥性水平的控制更加困難。要降低動(dòng)物源細(xì)菌的耐藥性，應(yīng)在畜禽養(yǎng)殖環(huán)節(jié)控制抗生素的使用，加強(qiáng)對畜禽養(yǎng)殖和相關(guān)產(chǎn)品細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測，以切實(shí)保障公共衛(wèi)生安全。