趙磊 陳康 程探宇

摘要：神經(jīng)毒劑，如沙林、梭曼和塔崩等都是劇毒的有機(jī)磷化合物，可以用作化學(xué)武器，主要是抑制乙酰膽堿酶的活性，進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)的紊亂，所以快速方便地檢測此類化合物具有重要的意義.設(shè)計并合成了一種以萘酰亞胺為熒光團(tuán)、肼基作為活性基團(tuán)的快速響應(yīng)熒光探針（PND），該探針可用于檢測神經(jīng)毒劑模擬物：氯磷酸二乙酯（DCP）和氰基磷酸二乙酯（DCNP），而且表現(xiàn)出了高選擇性和高靈敏度.

關(guān)鍵詞：熒光探針;萘酰亞胺;水合肼;神經(jīng)性毒劑

中圖分類號：0 657.34

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5137（2020）02-0184-07

0引 言

神經(jīng)毒劑，沙林、梭曼、塔崩等是一類具有致命劇毒性的有機(jī)磷化合物，如圖1所示，可用作化學(xué)武器等，其毒性高、致命快的特點，對人體安全構(gòu)成了威脅[1-2].神經(jīng)毒劑生產(chǎn)成本低，簡單易得，且廣泛使用[3-5].這些無色無味的毒劑形式多樣，主要有氣體、氣溶膠或液體等形式，很容易被動物和人類吸人，或通過皮膚接觸吸收，導(dǎo)致死亡，雖然一些國際條約禁止發(fā)展、生產(chǎn)和儲存化學(xué)武器，但一些國家仍在對其進(jìn)行研究[2，5-6].神經(jīng)毒劑進(jìn)入人體的作用機(jī)制主要是抑制蛋白酶的活性，尤其是乙酰膽堿酯酶的活性，乙酰膽堿酯酶是人體內(nèi)的中樞神經(jīng)酶，神經(jīng)毒劑與膽堿酯酶結(jié)合成穩(wěn)定的磷?；憠A酯酶，使膽堿酯酶喪失分解乙酰膽堿的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿在神經(jīng)突觸連接處的過度積累，會造成肌肉松弛障礙、神經(jīng)紊亂甚至死亡，因此，對于神經(jīng)毒劑的檢測變得尤為重要[7-10].2016年，KIM等iiii報道了一種熒光探針o-OH檢測神經(jīng)毒劑模擬物氯磷酸二乙酯（DCP），如圖2所示，該熒光探針o-OH能夠檢測和定量固定在固體基質(zhì)上的溶液和氣相中的有機(jī)磷神經(jīng)毒劑模擬物，通過抑制反應(yīng)性酚醛酸磷酸化后的內(nèi)旋，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光“打開”響應(yīng)，探針o-OH在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中熒光信號很弱，熒光量子產(chǎn)率（ΦF）為0.002，與DCP作用以后，得到探針o-Ophos，探針o-Ophos在DMF中表現(xiàn)出很強(qiáng)的熒光信號，ΦF為0.490，具有選擇性好、靈敏度高、熒光信號變化明顯等優(yōu)點.

由于神經(jīng)毒劑的毒性大且生產(chǎn)方便，發(fā)展高靈敏度和高選擇性的檢測方法已成為該領(lǐng)域的一個研究熱點，目前，基于電位法、表面聲波光譜法、酶法、電化學(xué)、氣相色譜/質(zhì)譜法等方法，已經(jīng)發(fā)展出多種檢測神經(jīng)毒劑的方法[10，12-14].這些方法具有靈敏度高、操作簡單、可移植性好等優(yōu)點[11].迄今為止報道的用于檢測有機(jī)磷神經(jīng)毒劑的熒光探針大多采用了常見的傳感方案[15-17]，探針的響應(yīng)主要取決于神經(jīng)毒劑的親電性，從而導(dǎo)致磷酸鹽酯中間體的形成，將磷酸基通過親核反應(yīng)轉(zhuǎn)移到含氮（N）或氧（0）的基團(tuán)上，如羥基、氨基、肟基、羰基等，能調(diào)節(jié)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）、內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）[18]、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等能量/電子/電荷轉(zhuǎn)移過程[4，15，19-20]，最后，這些探針可以被不同波段的光激發(fā)表現(xiàn)出不同的熒光信號，從而實現(xiàn)對神經(jīng)毒劑的檢測.在各種熒光基團(tuán)中，萘酰亞胺熒光團(tuán)顯示出明顯的優(yōu)勢，例如，高發(fā)光量子產(chǎn)率、強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，以及易于支架修飾等特點[21-23].本文作者通過萘酰亞胺為母體和水合肼反應(yīng)形成探針PND，用于快速、靈敏地檢測神經(jīng)毒劑模擬物.

1實驗部分

1.1 儀器和試劑

主要儀器：核磁共振儀（400 MHz），DRX-400，Bruker;紫外一可見光分光光度計，UV-3900，Hitachi;熒光光譜儀，F(xiàn)-7000，Hitachi.

主要試劑：二氯甲烷（泰坦科技），無水乙純（泰坦科技），石油醚（泰坦科技），乙酸乙酯（泰坦科技），甲醇（泰坦科技），柱層析硅膠（200～300目，黃海），乙腈（安耐吉），N，N-=異丙基乙胺（分析純AR，麥克林），乙二醇單甲醚（分析純AR，麥克林），DCP，氰基磷酸二乙酯（DCNP），水合肼（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，安耐吉），N，N-二甲基甲酰胺（安耐吉），4-溴一l，8一萘二甲酸酐（安耐吉）.

1.2實驗合成

1.2.1化合物2的合成[24]

如圖3所示，首先將4-溴一l，8一萘二酸酐（831 mg，2.9 mmol）和正丁胺（279 mg，3 mmol）放入50 mL的燒瓶中，加入10 mL無水乙醇溶解，}昆合物加熱回流5 h.反應(yīng)完全后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去溶劑，經(jīng)柱層析（V（石油醚）/v（二氯甲烷）=1：2）純化粗殘渣，得到純凈的化合物2為淡黃色固體（877 mg，74%產(chǎn)率）.lH NMR（ 400 MHz， CDCl3 ）8， 8.57（ dd ，J=7.3， 1.2 Hz， 1H）， 8.47（ dd，J=8.5， 1.1 Hz， 1H）， 8.33 （d，J=7.8Hz， 1H）， 7.95 （d， J=7.9 Hz， 1H）， 7.76（ dd， J=8.5， 7.3 Hz， 1H）， 4.15—4.02（ m， 2H）， 1.70—1.58（ m， 2H）， 1.43～1.30（ m， 2H）， 0.90 （t， J=7.4 Hz， 3H）.13C NMR（ 100 MHz， CDCl3）8，163.52， 133.08， 13 1.91， 131.10， 13 1.02，13 0.53， 130.08， 128.90， 12 8.00， 123.12， 122.26，40.36， 30.16， 20.36， 13.82.

1.2.2 化合物PND的合成[25]

如圖3所示，稱取1.0 g化合物2加入到燒瓶中，用10 mL乙二醇單甲醚溶解后120℃回流，直到溶液變得澄清，之后向燒瓶中緩慢滴加1 mL，80%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的水合肼攪拌10 min，在氮氣（N2）保護(hù)的條件下回流4h，TLC點板監(jiān)控反應(yīng)，反應(yīng)完全冷卻至室溫后，晶體過濾分離，用乙醇洗滌多次后，得到淡黃色固體PND 0.81 g，產(chǎn)率為94%.1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ，9.12（s，1H），8.89～8.16（m，3H），7.63（t，J=8.0 Hz， 1H）， 7.24 （d， J=8.6 Hz， 1H）， 4.67 （s， 2H）， 4.25～3.87 （m， 2H）， 1.82～1.49 （m， 2H）， 1.45～1.16 （m，2H） ，0.92（t，J=7.3 Hz，3H）.

2熒光探針的性能測試

2.1 PND反應(yīng)體系隨時間變化的測試

l cm的石英比色皿中加入2 mL PND溶液（10uL，10 umol·L-1），隨后加入DCP或DCNP（20 uL，20 umol·L-1），混合均勻后，在DMF中測試探針PND隨反應(yīng)時間的光譜變化.

2.2 PND反應(yīng)體系的濃度滴定實驗

l cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 uL，10 umol·L-l），隨后逐漸滴加DCP或DCNP（2 uL，2 umol·L-1），混合均勻后，在DMF中測試體系的光譜變化，滴加到體系熒光強(qiáng)度不再變化為止.

2.3 PND對不同神經(jīng)毒劑模擬物的選擇性實驗

l cm石英比色皿中加入2 mL的PND溶液（10 uL，10 umol ·L-1），隨后分別加入3種不同種類的神經(jīng)毒劑模擬物：甲基膦酸二甲酯（DMMP）、磷酸三乙酯（TEP）和磷酸三丁酯（HBT）（20 uL，20umol·L-1），混合均與后，在DMF中測試PND對不同神經(jīng)模擬物的熒光強(qiáng)度變化.

3結(jié)果與討論

3.1 PND反應(yīng)體系隨反應(yīng)時間的光譜變化

由于DCP和DCNP容易水解，選定DMF作為測試體系，為了確定PND與毒劑模擬物DCP和DCNP的反應(yīng)時間，首先測定了PND對DCP的響應(yīng)時間曲線，如圖4所示，探針PND（10 uL）在體系中，在420 nm出現(xiàn)了特征吸收峰，在加入20 umol的DCP之后，溶液的紫外吸收光譜發(fā)生了藍(lán)移，圖4（a）所示，在380 nm處出現(xiàn)了新的吸收峰，在395 nm處有一個等吸收點，這可能是因為連接萘酰亞胺的N上的孤對電子被磷束縛，由于誘導(dǎo)反應(yīng)從而降低了N的給電子能力，導(dǎo)致了吸收的藍(lán)移.同時，如圖4（b）所示，探針PND初始熒光信號很弱，在加入DCP后，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，最終熒光強(qiáng)度穩(wěn)定不變，通由圖4（b）的插圖可以看出，加入DCP 5 min后熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，這表明DCP與PND基本反應(yīng)完全，由于DCP和DCNP有著類似的化學(xué)性質(zhì)，在相同條件下也能表現(xiàn)出非常相似的光譜變化.DCP和DCNP都可以使探針PND的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，這可能是由于肼基與磷酸二乙酯的結(jié)合導(dǎo)致探針母體的PET過程受阻，其反應(yīng)機(jī)制如圖5所示，

3.2 PND反應(yīng)體系的濃度滴定實驗

對PND反應(yīng)體系進(jìn)行了濃度滴定實驗，如圖6所示，在沒有DCP的情況下，幾乎沒有觀察到PND在DMF中的熒光強(qiáng)度，當(dāng)加入0.2當(dāng)量（即2uL，2umol·L-1）DCP時，探針的紫外光譜強(qiáng)度明顯降低和藍(lán)移，如圖6（a）所示.而在520 nm處的熒光迅速增強(qiáng)，如圖6（b）所示，隨著DCP的逐步滴加，熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)DCP物質(zhì)的量濃度達(dá)到20 umol·L-1時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大且穩(wěn)定不變.此外，從圖6（a），6（b）的插圖可以看出熒光和紫外展現(xiàn)出相似的結(jié)果，與自由探針PND相比，探針復(fù)合DCP后的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了100倍，這些變化可歸因于磷酰胺阻斷了孤對電子的給電子能力，進(jìn)而導(dǎo)致PET關(guān)閉，使熒光增強(qiáng).圖6（c），6（d）為PND對DCNP物質(zhì)的量濃度滴定的紫外光譜和熒光光譜圖，由于DCNP和DCP有著類似的性質(zhì)，所測得的光譜幾乎一致.另外，如圖7所示，在DMF測試體系中，探針PND隨DCP濃度增大，熒光信號逐漸增強(qiáng)，

3.3 PND對不同毒劑模擬物的選擇性實驗

為了進(jìn)一步確定探針PND的選擇性，采用了3種有機(jī)磷化合物DMMP，TEP和HBT作為潛在的干擾物，如圖8所示.當(dāng)存在DCP和DCNP時，PND在520 nm處產(chǎn)生熒光的明顯增強(qiáng)，并且其他干擾物的溶液熒光沒有明顯變化.由此可見，探針PND對毒劑模擬物DCP和DCNP有很好的選擇性.

4結(jié)論

本文設(shè)計并合成了基于萘酰亞胺的熒光傳感器，用于神經(jīng)毒劑模擬物DCP和DCNP的檢測，隨著DCP或DCNP的加入，體系的熒光明顯增強(qiáng)（開關(guān)響應(yīng)），另外探針PND對其他模擬物無明顯響應(yīng).因此，PND對神經(jīng)毒劑的檢測具有很高的靈敏度和選擇性.從基礎(chǔ)科學(xué)的角度來看，PND作為神經(jīng)毒劑探針具有多種優(yōu)點，例如涉及簡單的合成程序和實時檢測，并且可以提供顏色和熒光變化，以幫助實現(xiàn)更好的選擇性模式，總之，本文作者開發(fā)了一種熒光增強(qiáng)型探針PND，可以高選擇性檢測神經(jīng)毒劑模擬物DCP和DCNP，具有一定的應(yīng)用價值.

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