吳昊 肖東方 應(yīng)葉 郭小玉 文穎 楊海峰

摘要：以鐵離子（Fe3+）為媒介，鞣酸還原氯金酸制備的金納米粒子（Au NPs）作為表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）基底，實(shí)現(xiàn)比色一散射光譜雙響應(yīng)，快速鑒別食品中的乙基麥芽酚.其中比色法中，對(duì)乙基麥芽酚的檢測(cè)限為0.50 mg·mL-1.SERS檢測(cè)中，利用Fe3+和乙基麥芽酚的絡(luò)合作用，乙基麥芽酚的最低檢測(cè)限降低到0.01 mg ·mL-1，線性范圍為0.05～1.00 mg·mL-1，該方法使用的儀器簡(jiǎn)單，操作方便，可對(duì)樣品中的乙基麥芽酚進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)直接測(cè)定，

關(guān)鍵詞：表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）;比色法;鐵離子（Fe3+）;乙基麥芽酚

中圖分類號(hào)：0 657.37 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-5137（2020）02-0167-08

0引 言

在食品中添加某些物質(zhì)起到掩蓋其不良品質(zhì)的事件層出不窮，例如花生油摻假事件，這不僅意味著消費(fèi)者權(quán)益受到損害，還往往伴隨著食品質(zhì)量不過(guò)關(guān)，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康.乙基麥芽酚是我國(guó)規(guī)定允許使用的食用香料，可作為煙草、飲料、糕點(diǎn)、香精、果酒、日用化妝品等物質(zhì)的增香劑以及香味改良劑[l-2]，但大量攝入會(huì)導(dǎo)致頭痛、嘔吐，并可能影響肝功能和腎功能[3].因此，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織和世界衛(wèi)生組織食品添加劑專業(yè)委員會(huì)規(guī)定：乙基麥芽酚人均每天的攝入量以體重計(jì)不能超過(guò)2 mg·kg-1，而食品加工中的指導(dǎo)用量為100—200 ug ·kg-1.

目前，對(duì)于乙基麥芽酚的檢測(cè)方法有氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、熒光分析法[6]等，其中氣相色譜方法相比于其他方法具有較高的準(zhǔn)確性及靈敏度，但是針對(duì)復(fù)雜樣品時(shí)，仍面臨著前處理過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、需要大型檢測(cè)儀器等缺點(diǎn)，而且乙基麥芽酚易揮發(fā)，限制了氣相色譜檢測(cè)方法在現(xiàn)場(chǎng)分析檢測(cè)中的應(yīng)用.

近年來(lái)，隨著便攜式拉曼光譜儀器的飛速發(fā)展，使本就具有痕量分析檢測(cè)[7-9]能力且樣品前處理相對(duì)簡(jiǎn)單[10-11]的表面增強(qiáng)拉曼散射（ SERS）技術(shù)能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速無(wú)損檢測(cè)，并被廣泛應(yīng)用于化學(xué)危害品、微生物污染物和生物毒素等的檢測(cè)，

本文作者設(shè)計(jì)了一種基于比色和表面增強(qiáng)拉曼光譜雙響應(yīng)的探針?lè)肿?，用于食品中乙基麥芽酚的檢測(cè)，圖l為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖.首先將鐵離子（Fe3+）加入到待測(cè)溶液中，當(dāng)待測(cè)體系中含有乙基麥芽酚這種物質(zhì)時(shí)，會(huì)形成紫紅色絡(luò)合物，肉眼可直接辨別，此時(shí)Fe3+起到“固定”乙基麥芽酚分子的作用，再通過(guò)拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)，乙基麥芽酚特征峰出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)比色一散射光譜兩種方式鑒別食品中的乙基麥酚.而當(dāng)體系中不存在乙基麥芽酚或者乙基麥芽酚含量不足，導(dǎo)致Fe3+剩余時(shí)，剩余的Fe3+又與基底表面的鞣酸分子作用，使金納米粒子（Au NPs）相互靠近，電磁場(chǎng)增強(qiáng)，引起“熱點(diǎn)”增多，從而鞣酸信號(hào)增強(qiáng)，通過(guò)乙基麥芽酚特征峰強(qiáng)度的降低以及鞣酸特征峰信號(hào)的增強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)乙基麥芽酚實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè).

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑

乙基麥芽酚購(gòu)買于阿拉丁試劑公司，分析純（AR）;羅丹明6G、氯金酸、氯化鐵以及鞣酸均購(gòu)置于國(guó)藥試劑公司，均為AR;食用油從沃爾瑪超市購(gòu)買;實(shí)驗(yàn)中所用純水均為自制的二次去離子水，

所有的試劑和化學(xué)品均直接使用.實(shí)驗(yàn)玻璃儀器均用王水（濃鹽酸和濃硝酸體積比為3：1混合）浸泡洗滌，再以二次去離子水沖洗.

1.2儀器

掃描電子顯微鏡（ SEM），S-4800型（Hitachi Co.，Ltd.）;7504紫外一可見(jiàn)分光光度儀，上海新茂儀器有限公司;ENWAVE（ Optronics） Prott-EZ-Raman-A2型便攜式拉曼光譜儀，二極管激光器激發(fā)光波長(zhǎng)為785 nm，其激發(fā)光源最大可調(diào)激光功率為300 mW，掃描時(shí)間為5s，累積時(shí)間為3次.

1.3

Au NPs的制備

Au NPs的制備受SLOT等[12]工作的啟發(fā)，以鞣酸為還原劑制備Au NPs.將3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的氯金酸加入到100 mL三角燒瓶中，加入97 mL去離子水，煮沸15 min后，在劇烈攪拌條件下逐滴加入1.20 mL物質(zhì)的量濃度為5xl0-3mol·L-1的鞣酸溶液，待溶液完全變成紫紅色，停止加熱并攪拌冷卻至室溫即可得到Au NPs.

取8 mL上述Au納米溶膠在8 000 r·min-I條件離心5 min，去掉上層清液，用去離子水洗滌2次后使用.1.4乙基麥芽酚純品的測(cè)試

稱取0.10 g的乙基麥芽酚固體粉末加入10 mL容量瓶中，配置成質(zhì)量濃度為10 mg· mL-1的母液，然后用去離子水逐步稀釋成梯度濃度（7.500，5.000，2.500，1.000，0.750，0.500，0.250，0.100，0.075，0.050，0.010 mg·mL-1）溶液待用.

將一定量Fe3+分別加入到不同質(zhì)量濃度的乙基麥芽酚溶液中，使之反應(yīng)形成絡(luò)合物，然后取3 mL混合后的溶液與制備的Au NPs以1：1的體積比均勻混合，再取10 uL混合溶液滴在干凈的鋁箔上，待樣品室溫干燥后進(jìn)行SERS測(cè)試.

1.5實(shí)際樣品中乙基麥芽酚的檢測(cè)

在進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí)，由于乙基麥芽酚易溶于水，因此直接將Fe3+加入到5 mL食用油樣品中，超聲萃取5 min，然后取3 mL水層溶液與3 mL離心后的Au NPs充分混勻后，取10 uL混合后的溶液滴在干凈的鋁箔上，待樣品室溫干燥后進(jìn)行SERS測(cè)試.

作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，進(jìn)行加標(biāo)測(cè)試.向5 mL食用油樣品中加入乙基麥芽酚，充分混勻后，按照上述步驟進(jìn)行SERS測(cè)試.

2結(jié)果與討論

2.1

Au NPs的表征

首先對(duì)制備的Au NPs進(jìn)行了表征.圖2（a）為Au NPs的SEM圖，可以看出，Au NPs尺寸均一且分散均勻.圖2（b）為Au NPs在521nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰，根據(jù)公式可以計(jì)算出粒徑在16 nm左右（Au NPs粒徑公式：Y=0.401 7X+514.56，其中y為波長(zhǎng)，X為粒子直徑），可以看出這與圖2（a）中的粒徑大小相符.

2.2 比色法檢測(cè)乙基麥芽酚

受LIU等[13]工作的啟發(fā)，應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)實(shí)行兩步法快速、準(zhǔn)確可視化地檢測(cè)乙基麥芽酚，在本實(shí)驗(yàn)中，鞣酸以及乙基麥芽酚均可與Fe3+反應(yīng)，但是鞣酸以及乙基麥芽酚對(duì)Fe3+的競(jìng)爭(zhēng)能力相當(dāng)，因此，當(dāng)Fe3+與乙基麥芽酚發(fā)生反應(yīng)時(shí)，鞣酸的引入不會(huì)破壞乙基麥芽酚與Fe3+生成的絡(luò)合物.圖3為比色法檢測(cè)乙基麥芽酚（0，0.01，0.05.0.10.0.50，1.00，5.00 mg.mL-l），當(dāng)乙基麥芽酚的質(zhì)量濃度為0.50mg·mL-1時(shí)，可以觀察到明顯的顏色變化（溶液顏色從黃色變?yōu)樽霞t色）.溶液顏色隨著溶液中乙基麥芽酚的濃度增加而加深，而當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.50 mg·mL-l時(shí)，溶液的顏色就呈現(xiàn)出黃色.

2.3

Au NPs的SERS性能的考察

由于SERS基底增強(qiáng)效果的好壞直接影響著測(cè)試結(jié)果的靈敏度，因此對(duì)制備的納米粒子增強(qiáng)性能也作了考察，圖4是以羅丹明6C為探針?lè)肿拥镊匪徇€原的Au NPs增強(qiáng)性能的SERS圖譜，可以明顯觀測(cè)到羅丹明6G的特征峰，這是由于Au NPs的局域表面等離子體共振（LSPR），從而產(chǎn)生大量“熱點(diǎn)”.該基底對(duì)羅丹明6G的檢測(cè)限能達(dá)到5xl0-7 mol.L-l，靈敏度較好.

2.4 乙基麥芽酚的SERS研究

圖5為乙基麥芽酚的SERS圖譜與固體Raman圖譜對(duì)比，可以觀察到乙基麥芽酚的SERS圖譜與固體拉曼圖譜幾乎完全一致，無(wú)明顯特征峰被選擇性增強(qiáng)，因此猜測(cè)乙基麥芽酚在基底表面無(wú)特異性吸附作用.并利用高斯軟件對(duì)乙基麥芽酚的SERS譜峰進(jìn)行了歸屬，693 cm-1對(duì)應(yīng)為乙基麥芽酚的Vs（C-O）以及Vs（C-C-C）振動(dòng)模式，1034 cm-1對(duì)應(yīng)為乙基麥芽酚的Vas（ C-O-C）以及Vas（C—C）振動(dòng)模式，1 643 cm-1對(duì)應(yīng)為Vs（C=C）以及8（C-O-H）振動(dòng)模式.

然而在不引入Fe3+的情況下進(jìn)行乙基麥芽酚SERS直接測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于乙基麥芽酚作為增香類食品添加劑，是一種揮發(fā)性小分子，在上述實(shí)驗(yàn)中也表明與基底無(wú)特異性作用，并且由于SERS測(cè)試時(shí)受環(huán)境溫度及濕度影響較大，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，乙基麥芽酚的SERS信號(hào)也會(huì)隨之發(fā)生變化.圖6為在20℃，60%相對(duì)濕度條件下，2.50 mg.mL-1的乙基麥芽酚SERS強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖譜.從圖6中可以看出，當(dāng)不引入Fe3+時(shí)，孵育時(shí)間為38 min時(shí)會(huì)獲得最佳信號(hào)，這不僅耗時(shí)長(zhǎng)，還難以實(shí)現(xiàn)乙基麥芽酚的準(zhǔn)確定量測(cè)定.同時(shí)，在不引入Fe3+的情況下，由于乙基麥芽酚與基底的非特異性吸附，乙基麥芽酚的最低可檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1，此方法的靈敏度不高，結(jié)果如圖7所示.

因此考慮使用Fe3+，將乙基麥芽酚“固定”下來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，并首先對(duì)所用Fe3+濃度進(jìn)行了實(shí)驗(yàn).圖8為Fe3+濃度測(cè)試結(jié)果.從圖8中可以看出，當(dāng)Fe3+物質(zhì)的量濃度為0.16 mg·mL-l時(shí)，SERS信號(hào)最強(qiáng).因此選擇0.16 mg·mL-l的Fe3+為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

當(dāng)引入Fe“時(shí)，發(fā)現(xiàn)在l 339 cm-1以及l(fā) 479 cm-l處出現(xiàn)鞣酸的特征峰，當(dāng)溶液中乙基麥芽酚濃度較低時(shí)，過(guò)量的Fe3+會(huì)與鞣酸結(jié)合，拉近Au NPs之間的距離，增強(qiáng)鞣酸的信號(hào)，SERS測(cè)試結(jié)果如圖9所示，同時(shí)以1 034 cm-l處為乙基麥芽酚特征峰進(jìn)行線性分析，結(jié)果如圖lO（a）所示，此時(shí)線性范圍為0.10～1.00 mg·mL-1.而當(dāng)引入1339 cm-1鞣酸特征峰作為競(jìng)爭(zhēng)因子時(shí)，以1 034 cm-l與1339 cm-1的比值進(jìn)行線性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，最低可檢測(cè)濃度為0.01 mg·mL-1，線性范圍為0.05～1.00 mg/mL，線性范圍更寬，結(jié)果如圖lO（b）所示.

2.5乙基麥芽酚實(shí)際樣品的檢測(cè)

在模擬實(shí)際樣品測(cè)試時(shí)，進(jìn)行加標(biāo)測(cè)試，分別向花生油中添加0.400 0 mg·mL-l和0.800 0 mg·mL-l的乙基麥芽酚，加標(biāo)測(cè)試結(jié)果如表l所示.從表1中可以看出，回收率在89.90/0～103.5%之間，回收率良好.

3結(jié)語(yǔ)

引入Fe3+為媒介，F(xiàn)e3+與乙基麥芽酚會(huì)形成紫紅色絡(luò)合物，實(shí)現(xiàn)顏色的初步判別，再以拉曼儀器進(jìn)行測(cè)試乙基麥芽酚特征散射峰，實(shí)現(xiàn)比色一散射光譜兩種方式鑒別食品中的乙基麥芽酚.而過(guò)量的Fe3+又會(huì)與基底表面的鞣酸作用，拉近Au NPs之間的距離，引起鞣酸特征峰的增強(qiáng)，通過(guò)乙基麥芽酚特征峰與鞣酸特征峰峰強(qiáng)的比值實(shí)現(xiàn)定量測(cè)試，不僅克服了揮發(fā)性小分子難以準(zhǔn)確測(cè)定的難題，也降低乙基麥芽酚的最低檢測(cè)濃度.在進(jìn)行實(shí)際樣品加標(biāo)測(cè)試時(shí)，回收率在89.9%～103.5%之間，回收率良好.

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