李亞男 王 松 叢海林,2 于 冰,2*

(1.青島大學(xué)生物醫(yī)用材料與工程研究院，青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島 266071；2.生物多糖纖維成形與生態(tài)紡織國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266071)

細(xì)胞膜色譜(CMC)于1996年由何教授[1]首次建立，是在生物學(xué)和色譜學(xué)的基礎(chǔ)上，研究流動(dòng)相中有效成分與受體相互作用規(guī)律的方法。由于具有檢測(cè)快速，靈敏度高等特點(diǎn)，細(xì)胞膜色譜法已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中的活性成分篩選，以及藥物與受體之間相互作用方式。在細(xì)胞膜色譜制備過(guò)程中，通過(guò)將細(xì)胞膜以物理吸附或者化學(xué)鍵合的方式鍵合在多孔二氧化硅微球載體上，以形成細(xì)胞膜固定相(CMSP)，并結(jié)合高效液相色譜，檢測(cè)不同成分的保留時(shí)間或質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而推斷其中的有效成分。細(xì)胞膜色譜法同時(shí)具有生物特性和色譜特性，對(duì)于研究潛在活性成分與受體之間的關(guān)系具有重要意義[2, 3]。細(xì)胞膜色譜法無(wú)需額外對(duì)材料進(jìn)行提取分離，這為檢測(cè)過(guò)程提供了很多便利；但由于細(xì)胞膜色譜柱制備過(guò)程比較復(fù)雜，且細(xì)胞膜吸附不完全，因此存在細(xì)胞膜用量大、表面膜蛋白易變質(zhì)、細(xì)胞膜易脫落、柱壽命短和效率低等缺點(diǎn)[4-6]。盡管如此，由于細(xì)胞膜色譜具有靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，還是被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中的活性成分篩選，以及藥物與受體相互作用方式等領(lǐng)域[7]。

1 細(xì)胞膜色譜柱的改進(jìn)

Ding 等[8]對(duì)細(xì)胞膜色譜柱的制備過(guò)程中的細(xì)胞用量、細(xì)胞破碎和裝柱流程等步驟進(jìn)行了探究，分別以大鼠肝星形細(xì)胞HSC-T6 和人肝癌細(xì)胞SMMC-7721建立了細(xì)胞膜色譜模型。該研究對(duì)比了不同實(shí)驗(yàn)條件下的保留效果，最終確定最佳細(xì)胞用量為3.5×107個(gè)，細(xì)胞破碎的最優(yōu)條件為5個(gè)循環(huán)(400 W，2 S超聲，20 S間隔)。通過(guò)流程的優(yōu)化，Ding等實(shí)現(xiàn)了更穩(wěn)定的細(xì)胞膜色譜柱壓，以及更高的柱效。

柱壓大導(dǎo)致細(xì)胞膜從微球固定相表面脫落是細(xì)胞膜色譜在使用過(guò)程中可能存在的情況[9]。因此，Ding等[8]采用多聚甲醛對(duì)細(xì)胞膜的固定相進(jìn)行了處理，處理后的固定相載體可與細(xì)胞膜結(jié)合的更加牢固，系統(tǒng)穩(wěn)定性得到了明顯的提高。這是由于多聚甲醛與膜表面蛋白氨基發(fā)生交聯(lián)，結(jié)合更加牢固，同時(shí)能夠不破壞膜蛋白的空間構(gòu)型，從宏觀上穩(wěn)定了細(xì)胞膜。但該方法有可能破壞細(xì)胞膜表面受體的活性，導(dǎo)致柱效下降。因此該課題組隨后發(fā)現(xiàn)，使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)對(duì)硅膠載體進(jìn)行修飾[10]，如圖1所示，該方法實(shí)現(xiàn)了硅膠載體和細(xì)胞膜之間的共價(jià)鍵結(jié)合，打破了傳統(tǒng)條件下細(xì)胞膜和固定相載體之間主要靠氫鍵和范德華力的非共價(jià)結(jié)合的方式。該方法將柱壽命延長(zhǎng)到12天，顯著提高了細(xì)胞膜色譜柱穩(wěn)定性，并避免了對(duì)細(xì)胞膜表面蛋白的破壞。

圖1 APTES修飾多孔硅球載體鍵合細(xì)胞膜過(guò)程[10]

在細(xì)胞膜色譜柱的傳統(tǒng)制備過(guò)程中，除工藝條件外，需要大量細(xì)胞膜作為固定相也為色譜柱的制備造成了極大的困難并限制了細(xì)胞膜色譜柱的應(yīng)用。因此Tang等[11]首次提出細(xì)胞膜毛細(xì)管色譜法(cMCC)解決了該問(wèn)題。其將小鼠的胰島細(xì)胞膜固定在用醛基官能化的毛細(xì)管內(nèi)壁上，測(cè)試了3種降血糖藥物，均有良好的保留。該方法下，色譜保留因子和穩(wěn)定性與普通細(xì)胞膜色譜相似,但細(xì)胞膜用量比傳統(tǒng)細(xì)胞膜色譜柱低數(shù)百倍，且靈敏度較高。該方法極大地減少了色譜柱制備過(guò)程中的細(xì)胞消耗量。為了增強(qiáng)色譜柱的穩(wěn)定性和柱壽命，Xu等[12]使用N-羥基丁二酰亞胺(NHS)對(duì)毛細(xì)管柱上的硅基多孔層進(jìn)行了修飾，如圖2所示，該方法在涂層和細(xì)胞膜之間建立了共價(jià)鍵連接，相比之前的方法增強(qiáng)了測(cè)定結(jié)果的穩(wěn)定性和柱壽命。該研究分別建立了SKBR3/mCMC 和 BALL1/mCMC模型，在顯著延長(zhǎng)毛細(xì)管柱壽命的同時(shí)，觀察到了抗癌藥物曲妥珠單抗的顯著保留。其中SKBR3/mCMC模型的柱壽命延長(zhǎng)至16天，BALL1/mCMC模型柱壽命延長(zhǎng)至14天。

在載體選擇方面，Wang等[13]首次以聚乙烯醇(PVA)修飾的聚醚醚酮管(PEEK)作為固定相載體，建立了新型毛細(xì)管細(xì)胞膜色譜模型。聚醚醚酮管作為常用的HPLC管材料，具有良好的耐高壓性和機(jī)械強(qiáng)度，且相比較于硅膠材料，PEEK的pH穩(wěn)定性較高。該團(tuán)隊(duì)分別建立的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的色譜模型，以降鈣素和維拉帕米為樣品，驗(yàn)證了該模型的良好保留性能及重現(xiàn)性。整體柱的使用可以極大地縮短分離分析時(shí)間，為細(xì)胞膜色譜的發(fā)展提供了新的選擇和可能性。

2 細(xì)胞膜色譜法用于中藥活性成分的分離

近年來(lái)，中藥由于其良好的治療效果越來(lái)越受到全世界的認(rèn)可和關(guān)注。但是中藥作為天然產(chǎn)物，其化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜[14]，對(duì)中藥有效成分的研究帶來(lái)了巨大的難題。因此，提取、分離和鑒別中藥材料中活性成分是我們面臨的巨大難題。細(xì)胞膜色譜法因?yàn)樵谥兴幓钚猿煞趾Y選方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛的應(yīng)用于該領(lǐng)域，并獲得了快速的發(fā)展[15]。中藥活性成分的藥理作用不相同，不同細(xì)胞膜表面的受體也不同，因此選用不同的細(xì)胞膜可篩選不同的藥物成分。由于中藥成分十分復(fù)雜，因此采用一維細(xì)胞膜色譜法無(wú)法精確分離各個(gè)組分，可能存在柱效低的缺點(diǎn)，因此與其他技術(shù)聯(lián)用是非常有必要的。

2.1 細(xì)胞膜色譜法用于中藥抗癌活性成分的分離

由于整體調(diào)理和生物多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，中藥在癌癥治療過(guò)程中，有著非常重要的輔助作用。目前，臨床治療癌癥常將手術(shù)，放療，化學(xué)療法和中醫(yī)結(jié)合起來(lái)[16]。但是由于中藥成分復(fù)雜，有效成分不明確，在使用過(guò)程中存在許多副作用，為癌癥治療增加了潛在風(fēng)險(xiǎn)，因此提取并純化活性成分對(duì)中藥治療的發(fā)展有著重要的意義。

肝癌因?yàn)樗劳雎矢?，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。陳嘯飛等[17]建立了 HepG2/CMC-TOF/MS 全二維色譜系統(tǒng)，分別研究苦參和黃柏提取液中作用于高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的HepG2 肝癌細(xì)胞膜的有效成分，在色譜柱上均有良好的保留，如圖3所示，從苦參和黃柏中共篩選得到了4個(gè)潛在抗癌活性成分。并且在線串聯(lián)了飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF/MS)，在不使用對(duì)照組的條件下獲得了較為準(zhǔn)確的鑒別結(jié)果，同時(shí)極大地縮短了分離時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作步驟。Jia 等[18]也通過(guò)建立全二維 HepG2/CMC-C18/TOF-MS 分析系統(tǒng),對(duì)口服黃芩提取液中的抗肝癌活性成分進(jìn)行了篩選，并驗(yàn)證了其活性。

圖3 苦參和黃柏中潛在抗癌活性成分的色譜及相應(yīng)TOFMS圖[17]

很多中藥中含有普適的抗腫瘤活性成分。Zhang等[19]建立了酪氨酸367半胱氨酸-HEK293/CMC-HPLC-MS色譜模型，使用1-叔丁基-3-{2-[4-(二乙氨基)丁基氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基}脲、尼莫地平和醋酸地塞米松進(jìn)行了色譜柱重現(xiàn)性的評(píng)估，取得了較好的重現(xiàn)性結(jié)果。后繼續(xù)篩選得到了川穹中的細(xì)胞生長(zhǎng)因子4受體拮抗劑，并鑒定了其抗癌活性。呂等[20]建立了高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體細(xì)胞膜色譜CMC-HPLC二維系統(tǒng)，對(duì)中藥射干中抗腫瘤活性組分進(jìn)行了提取，并對(duì)篩選得到的成分進(jìn)行了MTT實(shí)驗(yàn)的毒性驗(yàn)證，證實(shí)了其活性成分的體外抑制作用。Sun等[21]建立了高表達(dá)的表皮生長(zhǎng)因子受體細(xì)胞膜色譜，篩選了黃芪中的抗腫瘤成分，并發(fā)現(xiàn)其有效成分的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合方式與吉非替尼相似，且低劑量范圍內(nèi)其抑制活性大于吉非替尼。Fu等[22]建立了表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4(FGFR4)雙重混合的細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)，其結(jié)合了HPLC-ESI-IT-TOF-MSn，分離出了苦參中的4種有效成分，并通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的驗(yàn)證了其抑制活性。

在泌尿系統(tǒng)方面，學(xué)者們也做出了很多努力。Zheng等[23]建立了DU145/CMC系統(tǒng)從大黃中篩選抗前列腺癌的成分。通過(guò)該系統(tǒng)篩選得到了13種活性組分，并通過(guò)進(jìn)一步篩選發(fā)現(xiàn)大黃素具有良好的膜結(jié)合性能，通過(guò)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們對(duì)DU145細(xì)胞具有理想的抑制作用。Wang等[24]建立了前列腺癌細(xì)胞PC-3/CMC色譜系統(tǒng)，篩選了黃芪中的抗前列腺癌活性成分。選擇吉非替尼和地塞米松分別作為陽(yáng)性和陰性藥物，以驗(yàn)證和優(yōu)化綜合二維色譜系統(tǒng)的選擇性和適用性。研究中發(fā)現(xiàn)了5種化合物，即槐果堿，苦參堿，氧化苦參堿，氧化苦參堿和黃腐酚，這5種化合物在PC-3/CMC上具有顯著的保留行為，并且通過(guò)飛行時(shí)間質(zhì)譜法進(jìn)行了明確鑒定。細(xì)胞增殖和凋亡檢測(cè)證實(shí)了這5種化合物均具有抗前列腺癌作用。其中苦參堿和黃腐酚具有良好的抑制作用，IC50分別為0.893和0.137 mg/mL。Wei等[25]建立了VEGFR/CMC系統(tǒng)，并成功地用于鑒定元胡提取物中的活性成分。并通過(guò)MTT分析證實(shí)了它們對(duì)VEGFR改造的HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性。

Yuan等[26]建立了MDA-MB-231/CMC-HPLC/MS系統(tǒng)用于快速篩選附子中的抗乳腺癌化合物。有效成分在細(xì)胞膜色譜上具有明顯的保留。后使用C18色譜柱富集保留級(jí)分，并通過(guò)二維反相色譜法進(jìn)行分析。最后，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)測(cè)試了保留級(jí)分的活性。結(jié)果得到了兩種保留組分，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了它們具有抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的活性。

中藥中抗腫瘤的活性成分眾多，通過(guò)細(xì)胞膜色譜的篩選，可以準(zhǔn)確得到中藥中的抗腫瘤活性成分，對(duì)于其進(jìn)一步的藥理學(xué)、毒理學(xué)研究提供了極大地便利，并對(duì)中藥的發(fā)展做出了重要的貢獻(xiàn)。

2.2 細(xì)胞膜色譜法用于中藥抗過(guò)敏活性成分的分離

過(guò)敏反應(yīng)，醫(yī)學(xué)上稱為變態(tài)性疾病，是免疫功能失調(diào)而引起的臨床癥候群。當(dāng)外來(lái)抗原性物質(zhì)進(jìn)去人體后，刺激體內(nèi)的免疫系統(tǒng)釋放特異性抗體并與抗原結(jié)合，隨后肥大細(xì)胞，嗜堿粒細(xì)胞等也因?yàn)槭艿酱碳ざ尫糯罅康倪^(guò)敏物質(zhì)，進(jìn)而引起過(guò)敏[27]。因?yàn)檫^(guò)敏反應(yīng)中刺激物的特殊性，細(xì)胞膜色譜可以快速方便的篩選出中藥中的過(guò)敏成分，使得細(xì)胞膜色譜被許多學(xué)者用于該領(lǐng)域

Lv等[28]開(kāi)發(fā)了LAD2/CMC-HPLC-IT-TOF/MS系統(tǒng)，以篩選、分析和鑒定野菊花注射液的致敏成分。餾分保留在LAD2/CMC色譜柱上，并鑒定為檸檬苦素(LN)。結(jié)果表明，野菊花注射液和LN可以通過(guò)增加組胺釋放來(lái)達(dá)到其過(guò)敏作用。研究開(kāi)發(fā)的LAD2/CMC-HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)可用于篩選復(fù)雜系統(tǒng)中的致敏成份。

Zhang等[29]建立了RBL-2H3/CMC-HPLC-MS模型成功地篩選并鑒定了來(lái)自木皂苷中的抗過(guò)敏成分。以這種方式將Tubeimoside A鑒定為潛在的過(guò)敏原，脫粒試驗(yàn)證實(shí)Tubeimoside A以劑量依賴的方式誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞脫粒。Han等[30]也通過(guò)2H3/CMC-HPLC-MS模型成功地篩選并鑒定了來(lái)自丁香衣原體的羥基紅花黃A作為潛在的抗過(guò)敏成分。藥理分析表明，羥基紅花黃A是抑制免疫球蛋白E抗原介導(dǎo)的脫粒的有效天然成分。

Guo等[31]建立了H1受體過(guò)表達(dá)細(xì)胞/細(xì)胞膜色譜法串聯(lián)質(zhì)譜的方法，用于篩選中藥注射液中潛在的組胺激活成分。通過(guò)篩選、分離和鑒定鹽酸苯海拉明，吉非替尼，坦索羅辛和尼群地平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，驗(yàn)證了該方法的可行性。篩選了中藥注射劑玉金注射液，并鑒定了作用于組胺H1受體的潛在抗過(guò)敏成分。

Lin等[32]通過(guò)高表達(dá)Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2細(xì)胞膜系統(tǒng)和高效液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在線聯(lián)用，在丹參注射液中鑒定出丹酚酸A和一對(duì)幾何異構(gòu)體(異戊烷酸C和丹酚酸C)為假過(guò)敏成分。通過(guò)體外測(cè)定評(píng)估了它們的假過(guò)敏活性，測(cè)定結(jié)果與在細(xì)胞膜色譜柱一致。進(jìn)一步研究表明，丹酚酸C是保留時(shí)間最長(zhǎng)的化合物，它通過(guò)與Mas相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體X2誘導(dǎo)假性過(guò)敏反應(yīng)。

Huang等[33]建立了RBL-2H3/CMC系統(tǒng)并在線聯(lián)用LC/MS，篩選了胡椒中的抗過(guò)敏成分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胡椒堿有顯著的抗過(guò)敏活性。

因?yàn)榧?xì)胞膜色譜的特殊性，該方法可以更加精準(zhǔn)的篩選致敏成分和抗過(guò)敏成分，并且準(zhǔn)確得到該成分直接作用的細(xì)胞，相比于其他的方法具有更加快速便捷的優(yōu)勢(shì)。因此，細(xì)胞膜色譜在過(guò)敏成分篩選方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 細(xì)胞膜色譜法應(yīng)用于心腦血管類(lèi)疾病活性成分篩選

心血管疾病是一種人類(lèi)常見(jiàn)疾病，中藥由于其多靶向位點(diǎn)等特點(diǎn)，被廣泛用于心腦血管疾病的治療[34, 35]。但由于穩(wěn)定性、安全性和副作用機(jī)制不明確，因此對(duì)中藥中的有效成分進(jìn)行進(jìn)一步純化是非常有必要的。

Yang等[36]建立了心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜色譜柱系統(tǒng)，用于篩選五味子中的抗心臟病疾病的活性成分。作者先以硝苯地平為標(biāo)準(zhǔn)樣，并與LC-MS離線聯(lián)用，驗(yàn)證了色譜柱的作用。隨后通過(guò)篩選，得到了可以與心臟細(xì)胞結(jié)合的活性成分。

Han等[37]開(kāi)發(fā)了HEK 293α1A/CMC-UHPLC-ESI-MS/MS色譜系統(tǒng)，并成功地用于鑒定白頭翁中的作用于血管的活性成分。藥理實(shí)驗(yàn)表明，篩選出的活性成分具有α1A腎上腺素能受體活性，對(duì)于血管疾病有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

由于阿霉素具有誘導(dǎo)心力衰竭的副作用，因此探究抗阿霉素藥物是非常有必要的。Chen等[4]分別建立了正常和病變大鼠心肌CMC分析系統(tǒng)，用于篩選烏頭堿中的抗阿霉素(DOX)活性成分。該研究從正常和病變的心肌CMC模型中總共保留了烏頭堿中具有相似結(jié)構(gòu)的16種潛在活性生物堿成分。與正常CMC模型相比，它們中的大多數(shù)對(duì)病變的心肌CMC的親和力均有明顯降低，分離出的化合物中，塔拉扎明(TALA)具有最高的親和力，隨后通過(guò)體外藥效學(xué)驗(yàn)證和靶標(biāo)鑒定實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了篩選結(jié)果。最終驗(yàn)證得到電壓依賴性鉀離子通道是TALA和14-乙?；?TALA的結(jié)合靶點(diǎn)，具有高親和力。

Yue等[38]建立了一種高表達(dá)β1AR/細(xì)胞膜色譜法(β1AR-CMC)離線聯(lián)用UPLC/MS方法，用于篩選黃連中的活性成分。在這項(xiàng)研究中，使用美托洛爾作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，因?yàn)閬?lái)自黃連的黃連堿被認(rèn)為是可以抑制β1AR的活性成分。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，黃連中篩選得到的活性成分可以減輕梗塞面積并釋放丙二醛(MDA)，具有減輕心肌損傷中的作用。在體外，黃連可以減少細(xì)胞凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起到了一定的保護(hù)作用。

由于細(xì)胞膜色譜柱的受體容量有限，因此高含量親和性化合物可能會(huì)導(dǎo)致色譜柱超載，從而導(dǎo)致其他陽(yáng)性候選藥物的信息不了解。為了避免這種影響，Liu等[39]提出了一種基于二維CMC和成分剔除的策略。為了發(fā)現(xiàn)紅曲米中潛在的心臟保護(hù)化合物，建立了具有大鼠心臟成肌細(xì)胞H9c2/CMC的模型。通過(guò)使用二維H9c2/CMC-HPLC/QTOF MS系統(tǒng)，首先篩選出三個(gè)成分。除去高含量親和性化合物后，又發(fā)現(xiàn)了另外四種生物活性化合物。通過(guò)兩輪篩選，避免了由高濃度或無(wú)窮大化合物引起的色譜柱超載，并富集了痕量化合物。

Chen等[40]建立了血小板/CMC結(jié)合離線UPLC-QTOF-MS/MS系統(tǒng)，以從丹參水提物中篩選抗血小板活性成分，該成分在中藥中可作為抗血小板聚集劑。得到了7種活性成分，此外，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸C和丹參素在血小板聚集體外測(cè)定中進(jìn)行了測(cè)試。結(jié)果表明它們的保留時(shí)間與抗血小板聚集活性密切相關(guān)。

多種研究表明，中藥中抗心血管疾病的活性成分并不是單一的，需要進(jìn)行進(jìn)一步的篩選和確認(rèn)，但是相比于其他的方法，細(xì)胞膜色譜法得到的活性成分更加準(zhǔn)確，且極大地縮小了篩選范圍，具有一定的應(yīng)用前景。

2.4 細(xì)胞膜色譜法應(yīng)用于其他疾病活性成分篩選

細(xì)胞膜色譜因?yàn)榭梢赃x取不同的細(xì)胞膜，因此在篩選抗其他多種疾病的活性成分方面也有著顯著的效果。

Liu等[41]提取了人牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞膜，建立了hPDLC/CMC-LC-MS系統(tǒng)，從黃連中提取得到了小檗堿，并驗(yàn)證了小檗堿是作用于人牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞的有效成分。隨后，該作者又利用該模型篩選了黃芩中的抗牙周炎活性成分[42]。

朱等人[43]報(bào)道了選取腎小球膜細(xì)胞篩選治療腎病的活性成分。結(jié)果顯示篩選得到的組分具有明顯的活性。

Fan等[44]利用大鼠子宮細(xì)胞膜建立了CMC-HPLC/MS系統(tǒng)，篩選的益母草中的活性成分。通過(guò)這種方法被篩選得到了活性化合物。體外藥理實(shí)驗(yàn)證明，該化合物具有促進(jìn)子宮收縮的作用，并可對(duì)產(chǎn)后出血產(chǎn)生影響。

Gu等[45]建立了大鼠系膜細(xì)胞HBZY-1/CMC系統(tǒng)，篩選牡丹皮中的抗糖尿病腎病活性成分。結(jié)果得到了8種化合物，并通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)證明了其有潛在活性。

Wu等[46]建立了二維K562/CMC系統(tǒng)，并與計(jì)算機(jī)靶標(biāo)識(shí)別相結(jié)合，篩選得到了中藥天然靛藍(lán)中的抗白血病活性成分。該課題成功地篩選得到了3個(gè)活性成分：靛玉紅、色胺酮和異鼠李素，并通過(guò)體外細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡試驗(yàn)驗(yàn)證了它們的抗白血病作用。

由此可見(jiàn)，在多種疾病方面，細(xì)胞膜色譜法可以快速準(zhǔn)確地篩選出中藥中的活性成分，并通過(guò)后續(xù)的生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物活性。細(xì)胞膜色譜的普適性在多種疾病中得到了體現(xiàn)。

3 細(xì)胞膜色譜法用于藥物與受體的相互作用

確定藥物與受體之間相互作用的方式對(duì)于藥理學(xué)的研究有重要的意義，研究表明，因?yàn)槭荏w蛋白的結(jié)構(gòu)和活性不會(huì)被破壞，因此細(xì)胞膜色譜法可用于研究藥物與受體之間相互作用的規(guī)律，相比于其他的方法具有高效，快速等優(yōu)點(diǎn)。

Ma等[47]通過(guò)大鼠腦組織細(xì)胞建立了細(xì)胞膜色譜模型，對(duì)治療精神分裂的藥物與多巴胺受體之間的相互作用進(jìn)行了研究。其中多巴胺的解離平衡常數(shù)(KD)為(4.87±0.35)×10-6M，奧氮平為(5.58±0.20)×10-7M，喹硫平為(5.22±0.12)×10-7M，安非他酮(4.50±0.37)×10-7M，多潘立酮(3.41±0.28)×10-7M。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合研究表明，多潘立酮，安非他酮，喹硫平和奧氮平占據(jù)了色譜柱上DAR的某些結(jié)合位點(diǎn)，從而阻礙了多巴胺的締合。

Zhan等[48]建立了以HEK293/EGFR細(xì)胞為固定相的細(xì)胞膜色譜模型，用以研究抗癌藥物的與表皮生長(zhǎng)因子受體之間的相互作用。從正面分析模型中，阿法替尼的解離平衡常數(shù)(K D)為6.05×10-7M，TPD7為6.91×10-7M，而HMQ1611為9.68×10-7M。相比于HMQ1611，TPD7具有更高的抑制作用，而TPD7和HMQ1611在HEK293/EGFR細(xì)胞中作用相似，因此表明TPD7可能是高表達(dá)EGFR的新型阻斷劑。

Ma等[49]建立了用于確定藥物膜受體親和力的CMC相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的KD值，以分析與膜受體(表皮生長(zhǎng)因子受體和血管緊張素II受體)結(jié)合的藥物的相對(duì)KD值。通過(guò)CMC相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法獲得的KD值與通過(guò)正面分析方法獲得的KD值具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

Wang等[50]用人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和HepG2分別建立了細(xì)胞膜色譜方法，并聯(lián)用HPLC/MS，建立了一個(gè)綜合的篩選平臺(tái)。這些系統(tǒng)隨后經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，并用于評(píng)估喹唑啉化合物的活性，喹唑啉化合物經(jīng)設(shè)計(jì)和合成后可靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2。還使用經(jīng)典的卡尺遷移率測(cè)定法測(cè)試了這些化合物對(duì)該受體的抑制活性。結(jié)果顯示這兩種方法之間的顯著相關(guān)性(R2 = 0.9565或0.9420)。

Yang等[51]開(kāi)發(fā)了HEK293-EGFR/CMC方法，以研究表皮生長(zhǎng)因子受體與配體吉非替尼，厄洛替尼，坎尼替尼，阿法替尼和凡德他尼的結(jié)合特征。使用吉非替尼作為標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析用于研究在EGFR特定結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生的相互作用。在吉非替尼占據(jù)的這些配體結(jié)合位點(diǎn)的HEK293-EGFR/CMC柱上測(cè)量位移能力，揭示了以下順序：吉非替尼(KD，8.49±0.11×10-7M)>厄洛替尼(KD，1.07 ±0.02×10-6M)>坎尼替尼(KD，1.41±0.07×10-6M)>阿法替尼(KD，1.80±0.12×10-6M)>凡德他尼(KD，1.99±0.03×10-6M)。此順序?qū)?yīng)于額葉位移分析估計(jì)的值和分子對(duì)接獲得的分?jǐn)?shù)。此外，熱力學(xué)分析表明，在EGFR與所有以上幾種配體結(jié)合的過(guò)程中，氫鍵或范德華力是主要的相互作用力。

Du等[52]以大鼠大腦紋狀體細(xì)胞膜為固定相建立了細(xì)胞膜色譜(CMC)系統(tǒng)，研究了5-羥色胺受體5-HT1D與川穹中的主要活性成分藁本內(nèi)酯相互作用的親和作用。以舒馬普坦為對(duì)照品，采用了競(jìng)爭(zhēng)抑制的手段，并使用額葉分析得到的舒馬曲坦和藁本內(nèi)酯的解離常數(shù)值分別為389 nmol/L和4.21 μmol/L。

4 細(xì)胞膜色譜法應(yīng)用于抗菌多肽的篩選

抗菌肽是指具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，一般呈堿性，且具有廣譜性，能夠迅速殺死細(xì)菌，成為了細(xì)菌疾病的潛在治療藥物。因此篩選和純化抗菌肽在醫(yī)用治療上具有重要的意義。由于抗菌肽具有分子量小和廣譜性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[53]。細(xì)胞膜色譜在抗菌肽的篩選方面也有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[54]。

Xiao等[55]提取了大腸桿菌的細(xì)胞膜，并建立了細(xì)胞膜色譜法與LC-MS離線串聯(lián)的方法，從麻風(fēng)樹(shù)籽中篩選得到了陽(yáng)離子抗菌肽(KVFLGLK，JCpep7)，抗菌測(cè)定表明JCpep7對(duì)多種微生物有殺傷作用?？咕鷻C(jī)制表明，JCpep7主要通過(guò)破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，然后裂解細(xì)胞來(lái)殺死微生物。結(jié)果表明，細(xì)胞膜親和層析可能是高通量篩選麻瘋樹(shù)抗菌肽的有前途的方法。Tang等[56]同樣利用大腸桿菌細(xì)胞膜，建立了細(xì)胞膜色譜法，從煮干的鳳尾魚(yú)中篩選得到了陽(yáng)離子抗菌肽(Apep10)，通過(guò)MOLDI-TOF-MS鑒定序列為GLARCLAGTL。經(jīng)抗菌檢測(cè)可得知Apep10對(duì)多種微生物有活性，且通過(guò)激光共聚焦(ZLSM)數(shù)據(jù)表明對(duì)小鼠紅細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性。

Tang等[57]使用釀酒酵母細(xì)胞膜離線串聯(lián)HPLC/MS建立了細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)，以從牛酪蛋白的胃蛋白酶水解物中分離靶向的抗菌肽。成功篩選了膜結(jié)合級(jí)分，并將將該肽的氨基酸序列鑒定為L(zhǎng)RLKKYKVPQL。還確定了肽的活性是相對(duì)熱穩(wěn)定的并且是pH依賴性的。在15 %Na+，K+和胃蛋白酶的存在下，它保留了90%以上的活性。胰蛋白酶，蛋白酶K，二價(jià)陽(yáng)離子Mg2 +和Ca2 +將活性降低到不同程度。

5 結(jié)論

細(xì)胞膜色譜基于直接鍵合在硅膠表面的細(xì)胞膜的特性，具有快速篩選中藥中特定活性成分的能力。相比于其他的方法，該方法具有高效、快速、靈敏及可重復(fù)性高的特點(diǎn)，并且通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)確定了其可靠性。盡管如此，鍵合在硅膠表面的細(xì)胞膜并不能完全模擬活細(xì)胞的活性和特性，因此可能存在篩選不完全的缺點(diǎn)，使細(xì)胞膜色譜的使用存在一定的局限性；同時(shí)，細(xì)胞膜色譜對(duì)細(xì)胞膜的大量需求也使其大規(guī)模使用成為受限瓶頸。細(xì)胞膜色譜在藥物篩選方面具有廣闊的前景，但是提高細(xì)胞膜色譜的活性以完整篩選活性成分，實(shí)現(xiàn)大批量、規(guī)模化的制備，是目前細(xì)胞膜色譜發(fā)展的主要方向。通過(guò)實(shí)現(xiàn)這些過(guò)程，細(xì)胞膜色譜將會(huì)越來(lái)越發(fā)揮重要作用，并得到越來(lái)越多的重視。