馬林，滕兆偉，陸聲

(昆明醫(yī)科大學解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院臨床學院，云南 昆明 650032)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是最常見的骨骼疾病，是一種以骨量低、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導致骨脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性骨病[1]。隨著人口老齡化，OP已經(jīng)成為全世界關注的健康問題。有報道稱在2006—2007年間全世界有2億婦女受骨質(zhì)疏松癥影響，每年造成890多萬例骨折，每3 s即發(fā)生1次骨質(zhì)疏松性骨折[2]。然而目前對OP的發(fā)病機制認識仍然有限。

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一類具有自我更新能力的多能干細胞，該細胞可以在體外培養(yǎng)并可以通過不同誘導液誘導為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞類型[3]。有研究表明與年齡有關的骨質(zhì)疏松癥與成骨細胞減少和骨髓中脂肪組織累積增加有關[4]，因此，深入了解BMSCs成骨分化與成脂肪分化的分子機制對于了解OP的發(fā)病機制具有重要意義。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid，miRNA)是一類內(nèi)生的、長度為20～29 nt的非編碼小RNA[5]，自從Lee等[6]首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來，越來越多的miRNA被人們所熟知。目前研究發(fā)現(xiàn)人類編碼miRNA的基因約占總基因的3%，然而這些少量的miRNA所調(diào)控的人類編碼基因卻占了總數(shù)的40%～90%，廣泛影響著細胞增殖、分化、凋亡等疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。研究表明多種miRNA參與BMSCs的分化[8]，由于miRNA體積小，易于進入細胞，因此被認為是未來治療OP的潛在方法。本文將對BMSCs成骨分化過程中涉及的主要四個信號通路Wnt、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)及Notch信號通路作一概述。

1 MiRNA調(diào)控BMSCs成骨分化信號通路機制

信號通路是指能將細胞外的分子信號經(jīng)細胞膜傳入細胞內(nèi)發(fā)揮效應的一系列酶促反應通路，在最近幾十年的深入研究中，已經(jīng)證實了多種miRNA參與BMSCs的成骨分化過程，越來越多的研究表明miRNA通過調(diào)控關鍵轉(zhuǎn)錄因子及信號通路，影響著BMSCs的成骨分化過程，各個信號通路存在著聯(lián)系，但目前關于這方面的報道相對較少。

1.1 Wnt信號通路 Wnt家族是由19種具有分泌功能的糖蛋白組成，參與各種生命活動過程，如細胞增殖、凋亡、間充質(zhì)干細胞的分化，包括依賴于β-catenin的經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典的Wnt信號通路[9]。Wnt蛋白通過與Frizzled受體及LPR5/6受體集合抑制β-catenin磷酸化，非磷酸化的β-catenin進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的表達[10]。越來越多證據(jù)表明，Wnt/β-catenin信號通路具有刺激成骨分化而抑制脂肪分化的作用，在促進成骨分化和保持骨量中具有關鍵作用[11]。

Hu等[12]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p能夠通過調(diào)節(jié)靶基因APC促進人成骨細胞(hFOB1.19)成骨分化，進一步通過轉(zhuǎn)染miR-142-3p模擬物使miR-142-3p表達上調(diào)，免疫蛋白印跡分析發(fā)現(xiàn)β-catenin表達上調(diào)，因此 miR-142-3p通過靶向調(diào)控APC使β-catenin表達上調(diào)促進成骨細胞分化。Miclea等[13]研究表明APC基因功能缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠成骨分化和成軟骨分化升高，進一步驗證了上述結(jié)果。有趣的是Hu等[14]發(fā)現(xiàn)miR-142-3p在人胚腎細胞(HEK293)中通過靶向調(diào)控CTNNB1基因抑制Wnt信號通路，CTNNB1是一種編碼β-catenin的基因。上述研究表明miR-142-3p通過調(diào)控不同靶基因既可以抑制Wnt信號通路，又可以促進Wnt信號通路而發(fā)揮不同的生物學效應。Wang等[15]發(fā)現(xiàn)在人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs)中miR-346通過與靶基因GSK-3β的3'-非編碼區(qū)(3'-UTR)結(jié)合，下調(diào)GSK-3B表達水平促進成骨分化，當敲除β-catenin后miR-346促進成骨細胞分化效應減弱。因此miR-346通過Wnt/β-catenin信號通路靶向調(diào)控GSK-3β促進成骨分化。Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在人脂肪源性間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived stem cells，hASCs)中miR-218通過靶向調(diào)節(jié)硬骨素(Sclerostin，SOST)促進成骨分化，SOST是Wnt信號通路的一種抑制因子，通過與Wnt信號通路LRP5/6受體結(jié)合發(fā)揮效應。Ma等[17]最近研究發(fā)現(xiàn)miR-96通過Wnt信號通路靶向下調(diào)SOST，使Wnt信號通路下游成骨核心轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達水平升高，促進強直性脊柱炎小鼠模型BMSCs成骨分化，因此在未來miR-96可能成為治療強直性脊柱炎的潛在靶點。

1.2 TGF-β信號通路 TGF-β超家族由超過30個生長和分化因子組成，包括TGF-βs和BMP，TGF-β信號通路參與細胞增殖、成骨細胞分化、胚胎發(fā)育等多種生命活動過程[18]。哺乳動物中有三種TGF-βs蛋白即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，研究表明TGF-β2在胚胎骨骼發(fā)育中占有重要作用，TGF-β2 功能缺陷小鼠將出現(xiàn)各種骨骼疾病，如骨質(zhì)疏松癥[19]。

Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-21可以通過TGF-β信號通路靶向調(diào)控SMAD7促進小鼠胚胎成骨前體細胞(MC3T3-E1)成骨分化，在成骨誘導過程中miR-21表達上調(diào)，SMAD7表達降低，敲除SMAD7可以促進MC3T3-E1細胞成骨分化及骨礦化。有趣的是Meng等[21]發(fā)現(xiàn)在人臍帶間充質(zhì)干細胞中miR-21也可以通過調(diào)控P13K/AKT信號通路促進成骨細胞分化，進一步通過實驗和生物學信息分析證實PTEN為miR-21調(diào)控P13/AKT信號通路的靶基因，當PTEN功能受到抑制時下游的Runx2和β-catenin活性升高促進成骨分化。Mei等[22]研究還發(fā)現(xiàn)miR-21還可以通過ERK/MAPK信號通路促進成骨細胞分化。上述研究證實miR-21可以通過不同的靶基因調(diào)控不同的信號通路發(fā)揮生物學效應。Bhushan等[23]研究表明在MC3T3-E1細胞成骨誘導分化過程中miR-181a上調(diào)，過表達miR-181a后發(fā)現(xiàn)早期成骨標志物堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性升高，茜素紅染色后鈣鹽結(jié)節(jié)增多。進一步通過生物學信息分析和熒光素酶實驗證實Rgs4和Gata6為miR-181a靶基因，miR-181a通過靶向調(diào)控Rgs4和Gata6在TGF-β信號通路中促進成骨分化。Bai等[24]最近研究發(fā)現(xiàn)在股骨頭壞死小鼠模型血清中miR-27a表達下調(diào)，miR-27a模擬物轉(zhuǎn)染MC3T3-E1細胞后，不僅Runx2、骨鈣素表達上調(diào)，ALP活性增強，而且TGF-β及Smad7蛋白表達升高。通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染TGF-β或Smad后，miR-27a對MC3T3-E1細胞的成骨分化效應增強，進一步證實miR-27a通過TGF-β信號通路促進MC3T3-E1細胞的成骨分化，因此通過miR-27a調(diào)控TGF-β信號通路可能成為未來治療股骨頭壞死的潛在靶點。

1.3 BMP信號通路 BMPs是TGF-β超家族中的一員，在調(diào)控成骨分化和骨生成中具有重要意義[25]。BMP信號通路也有經(jīng)典的信號通路和非經(jīng)典的信號通路，經(jīng)典的信號通路依賴于Smad，BMPs通過與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅰ和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ結(jié)合激活BMP信號通路[26]。哺乳動物中有14種BMPs，其中BMPs2，4，5，6，7，9在調(diào)控MSCs成骨分化過程中具有重要意義，Runx2是BMP信號通路的下游靶點，BMP2和BMP7在成骨分化過程中均上調(diào)Runx2的表達[25]。

在成骨分化過程中，miRNA參與BMP信號通路中關鍵因子的表達。Liu等[27]研究發(fā)現(xiàn)在對小鼠BMSCs成骨誘導過程中miR-155下調(diào)，過表達miR-155后，ALP活性下降，與成骨有關基因Runx2、Osterix(OSX)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋素(osteopontin，OPN)表達下降，進一步研究證實BMP9為miR-155靶基因，miR-155通過靶向調(diào)控BMP9抑制BMP信號通路而抑制成骨分化。Kim等[28]研究表明miR-196a參與調(diào)控hASCs的增殖及成骨分化過程，當miR-196a與靶基因HOXC8的3'UTR結(jié)合后抑制HADSCs增殖而促進成骨分化，HOXC8可抑制BMP-2表達，因此當miR-196a與HOXC8結(jié)合后，HOXC8下調(diào)而BMP-2上調(diào)，miR-196a通過BMP信號通路促進成骨分化。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)在hASCs及hMSCs成骨誘導過程中，miR-20a表達上調(diào)，進一步研究證實Bambi、Crim1和PPARγ是miR-20a的直接靶點，Bambi和Crim1是BMP信號通路的表面抑制因子，PPARγ是促進成脂分化的重要因子，激活的PPARγ可導致Runx2表達下降，miR-20a抑制靶基因Bambi、Crim1和PPARγ的表達通過BMP信號通路促進成骨分化。Cui等[30]研究發(fā)現(xiàn)敲除miR-185(KO)小鼠6周后，與野生型小鼠相比，KO小鼠的骨體積增加，熒光素實驗證實Bgn是miR-185的直接靶點，Bgn可以通過BMP/Smad信號通路促進成骨分化，miR-185靶向調(diào)節(jié)Bgn抑制BMP/Smad信號通路抑制成骨分化。

1.4 NOTCH信號通路 Notch信號通路由Notch配體、Notch受體(DSL蛋白)及細胞內(nèi)效應器分子(CSL-DNA結(jié)合蛋白)組成[31]。Notch信號通路參與細胞間信息傳遞，調(diào)控各種細胞的分化過程，在抑制BMSCs成脂肪分化過程中具有重要意義[32]。研究表明，阻斷Notch信號通路可通過PTEN-P13K/AKT/mTOR信號通路促進BMSCs自噬介導的脂肪分化[33]。除了對脂肪分化抑制作用外，Notch信號通路還可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路抑制成骨分化[34]。然而，也有研究表明Notch信號通路可以通過調(diào)節(jié)BMP2的表達促進成骨分化[35]。因此，Notch信號通路可通過直接靶向相關基因或與其他信號通路相互作用，以復雜的方式調(diào)控MSCs的成骨和成脂分化過程。

Gamez等[36]研究發(fā)現(xiàn)在乳頭干細胞中Notch信號通路的激活抑制細胞分化，miR-34a過表達可促進成骨分化，進一步研究證明Notch2和HES1為miR-34a靶基因，miR-34a與Notch2、HES1的3'UTR區(qū)結(jié)合促進Runx2、OSX及OCN的表達。以上結(jié)果表明miR-34a通過靶向調(diào)節(jié)Notch2和HES1通過Notch信號通路促進成骨分化。Yang等[37]發(fā)現(xiàn)過表達miR-10a會促進hBMSCs成骨分化，轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后miR-34a與KLF4的3'UTR區(qū)結(jié)合抑制熒光素酶活性，miR-34a抑制靶基因KLF4表達促進hBMSCs成骨分化。Qu等[38]發(fā)現(xiàn)在黃韌帶骨化患者中黃韌帶細胞miR-199b-5p表達下降，進一步實驗證明JAG1是miR-199b-5p的靶基因，miR-199b-5p靶向調(diào)節(jié)JAG1通過Notch信號通路抑制成骨分化。

綜上所述，以上四種信號通路在調(diào)控BMSCs分化過程中發(fā)揮重要作用，此外與BMSCs分化相關的信號通路還有MAPK、ICF1/ET1、FAK、Hedgehog等信號通路。miRNA與多個信號通路及轉(zhuǎn)錄因子形成復雜的調(diào)控網(wǎng)絡，不同信號通路之間相互作用，調(diào)控著BMSCs的成骨分化。

2 結(jié) 語

隨著人口老齡化的加劇，OP已經(jīng)成為一個重要的健康問題。OP患者骨髓間充質(zhì)干細胞成骨能力減弱、成脂能力增強是導致骨質(zhì)疏松癥的原因之一，已發(fā)現(xiàn)大量miRNA參與轉(zhuǎn)錄因子或信號通路的調(diào)控，影響著BMSCs的成骨分化過程，這些信號通路及轉(zhuǎn)錄因子涉及復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。目前對OP的治療主要以雙磷酸鹽等骨吸收抑制劑為主[39]，但藥物副反應大，患者依從性差，治療效果不理想。BMSCs因具有多能性已經(jīng)成為細胞治療OP的熱點，因此改變BMSCs分化的方向，即促進成骨細胞分化抑制脂肪細胞分化成為潛在治療骨折疏松癥的策略。深入了解miRNA調(diào)控BMSCs分化分子機制可以進一步明確骨質(zhì)疏松的病因，為尋求新的分子診斷標志物及靶向治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。