王艷云，姚麗，王珊珊

鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院皮膚科，鄭州 450052

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）是臨床常見的皮膚惡性腫瘤，占所有皮膚腫瘤的50%[1]。MF分為斑片期、斑塊期和腫瘤期3個(gè)時(shí)期[2]。斑塊期和腫瘤期在臨床上較容易被明確診斷，因?yàn)檫@兩個(gè)時(shí)期的患者表現(xiàn)及組織病理學(xué)特征具有顯著特點(diǎn)，臨床診斷率高。而斑片期患者無顯著臨床癥狀，病理診斷結(jié)果也無特異性[3-4]。臨床醫(yī)師對MF早期的誤診率較高，斑片期腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少，容易與其他皮膚疾病混淆，且尚無特異性診斷指標(biāo)，對MF的早期診斷是一大難題。胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率族蛋白（thymocyte selection associated high mobility group box protein，TOX）是一種高遷移率家族蛋白，其作用是對機(jī)體的染色體進(jìn)行修飾[5]。研究報(bào)道，TOX幾乎不在正常皮膚中表達(dá)，而在CD4+CD8+腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[6-7]。推測TOX也許能夠作為MF的診斷指標(biāo)。本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測TOX蛋白在MF和良性炎癥性皮膚病患者中的表達(dá)情況，旨在探討TOX蛋白在MF患者中的表達(dá)及臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2020年1月于鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院就診的MF患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查確診為MF；②年齡＞18歲；③無其他皮膚疾??；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病等嚴(yán)重疾?。虎谌朐呵坝邢嚓P(guān)治療史。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入62例MF患者作為觀察組，其中斑片期25例，斑塊期24例，腫瘤期13例。斑片期患者中，男18例，女7例；平均年齡為（44.10±8.12）歲。斑塊期患者中，男16例，女8例；平均年齡為（43.05±9.50）歲。腫瘤期患者中，男9例，女4例；平均年齡為（43.65±9.11）歲。斑片期、斑塊期、腫瘤期患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。選取同期收治的良性炎癥性皮膚病患者30例作為對照組，其中尋常型銀屑病16例，慢性濕疹14例。觀察組中，男43例，女19例；平均年齡為（43.35±7.88）歲。對照組中，男 17例，女 13例；平均年齡為（41.18±8.20）歲。兩組患者的性別和年齡比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 檢測方法

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測兩組患者中TOX蛋白的表達(dá)情況。收集兩組患者的皮膚組織，常規(guī)制作石蠟組織切片。常規(guī)脫蠟和脫水，加入3%過氧化氫溶液，作用20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，加入0.01 mol/L、pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加50 μl兔抗人TOX多克隆抗體（稀釋比例為1∶100），于4℃搖床上孵育過夜，第2天洗板，再加入50 μl生物素化的羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素，室溫下孵育1 h；配制并加入0.04%的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，顯色5 min，并在顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。依次進(jìn)行蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水和中性樹膠封片。采用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為空白對照。

1.3 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

由兩名病理科醫(yī)師采用雙盲法判定染色結(jié)果。TOX蛋白陽性表達(dá)位于細(xì)胞核中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。隨機(jī)觀察5個(gè)400倍視野，每個(gè)視野選擇100個(gè)細(xì)胞，陽性細(xì)胞所占比例＜10%為陰性，≥10%為陽性[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用多因素方差分析；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者中TOX蛋白表達(dá)情況的比較

觀察組患者中TOX蛋白的陽性表達(dá)率為91.94%（57/62），明顯高于對照組的30.00%（9/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=38.253，P＜0.01）。

2.2 不同分期MF患者中TOX蛋白表達(dá)情況的比較

斑片期、斑塊期、腫瘤期MF患者中TOX蛋白的陽性表達(dá)率分別為80.00%（20/25）、100%（24/24）、100%（13/13），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.298，P＜0.05）；但兩兩比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

TOX基因編碼TOX蛋白，它是一種由一個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合蛋白，它與雙鏈DNA結(jié)合并使DNA解旋，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。TOX蛋白在所有脊椎動物中的結(jié)構(gòu)都非常相似，并與多種腫瘤有關(guān)，如肺癌、乳腺癌、淋巴瘤和白血病[10-11]。TOX蛋白包含一個(gè)DNA結(jié)合域，該結(jié)構(gòu)域可以通過修飾局部染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)各種蛋白質(zhì)復(fù)合物來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。盡管確切的機(jī)制尚不清楚，但研究表明TOX在胸腺細(xì)胞中的表達(dá)水平很高，離開胸腺并進(jìn)入周圍組織后，成熟的CD4+T細(xì)胞中TOX的表達(dá)水平很低[12-13]。

正常情況下，TOX蛋白在皮膚組織中不表達(dá)或表達(dá)水平很低，主要在淋巴組織和胃腸道腺細(xì)胞中表達(dá)[14]。胸腺中的TOX主要抑制CD4+前體細(xì)胞的降解，外周淋巴瘤中TOX mRNA和蛋白很少表達(dá)。研究表明，TOX基因在許多腫瘤中異常表達(dá)，如肺癌、乳腺癌和白血病[15-16]。另有研究表明，相對于良性炎癥性皮膚病患者，MF患者中TOX基因呈高表達(dá)，并且隨著疾病的發(fā)展，TOX基因的表達(dá)水平越來越高[17]。表明TOX基因異常表達(dá)可能與MF有關(guān)，但該研究結(jié)果仍有許多爭議。

本研究探討了TOX蛋白在MF患者中的表達(dá)情況及臨床意義，結(jié)果表明，觀察組中TOX蛋白的陽性表達(dá)率明顯高于對照組，說明TOX可能參與了MF的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明，TOX的過表達(dá)刺激了蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）的磷酸化，而AKT抑制劑能夠抑制TOX引起的增殖促進(jìn)作用[18]。推測TOX可能通過激活磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/AKT信號通路來促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。以上結(jié)果證實(shí)了TOX在MF患者中的過表達(dá)以及TOX與MF疾病進(jìn)展的關(guān)系。此外，TOX可能成為MF診斷及治療的重點(diǎn)靶基因。據(jù)報(bào)道，TOX可以誘導(dǎo)Myla細(xì)胞的增殖和遷移，通過干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制TOX還可減少M(fèi)yla細(xì)胞的增殖和遷移[19]。

DNA異常甲基化時(shí)常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖，誘發(fā)腫瘤產(chǎn)生，而且在腫瘤細(xì)胞中會進(jìn)一步出現(xiàn)抑癌基因和凋亡基因的表達(dá)異常。在基因突變及抑癌基因失活中，DNA異常甲基化發(fā)揮了很大的作用。異常甲基化決定多種類型腫瘤的表觀遺傳特點(diǎn)。研究表明，TOX基因的甲基化水平在肺癌和乳腺癌患者中顯著增加，基因決定蛋白表達(dá)，TOX蛋白通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移而在MF中發(fā)揮致病作用[20]。在某些腫瘤患者中，出現(xiàn)TOX基因缺失的現(xiàn)象，基因缺失可使抑癌基因失活，從而使其不能對相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，影響了細(xì)胞的增殖等過程，破壞了細(xì)胞的穩(wěn)定性。本研究結(jié)果顯示，TOX蛋白在MF患者中的表達(dá)水平較高，說明TOX蛋白的表達(dá)出現(xiàn)了異常。

本研究結(jié)果還顯示，斑片期MF患者中TOX蛋白的陽性表達(dá)率為80.00%，低于斑塊期和腫瘤期MF患者的100%，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分析原因可能是病例數(shù)較少。TOX蛋白在良性炎癥性皮膚病組織中也出現(xiàn)陽性，說明TOX蛋白并不是腫瘤細(xì)胞特有的，可以推斷陽性細(xì)胞的來源是淋巴細(xì)胞。然而某些炎癥組織中TOX蛋白低表達(dá)和腫瘤細(xì)胞中TOX蛋白高表達(dá)的機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。

目前對于MF的診斷尚無特異性方法，臨床中面臨許多困難，TOX蛋白在一些腫瘤患者的組織中呈高表達(dá)。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法檢測TOX蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TOX蛋白在MF患者中的表達(dá)水平較高，為臨床診斷提供了參考，但缺乏有關(guān)其作用機(jī)制的研究，仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，TOX蛋白在MF患者中的表達(dá)水平較高，可能在疾病進(jìn)展中具有一定作用，值得進(jìn)一步研究。