萬(wàn)丹丹，吳海霞，湯曼麗，彭 云，陳 茹，馬桂珍，暴增海*

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222000；2.南京醫(yī)科大學(xué)康達(dá)學(xué)院，江蘇連云港222000）

蘋(píng)果輪紋病是由葡萄座腔菌屬引起的，該病菌不僅會(huì)危害生長(zhǎng)期的果樹(shù)和果實(shí)，也會(huì)造成果實(shí)成熟期的爛果、落果，并且在貯藏期也會(huì)造成大量的爛果，是嚴(yán)重危害蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的病害之一。除危害蘋(píng)果外，還可侵染梨、桃、杏等多種果樹(shù)，對(duì)果樹(shù)的生長(zhǎng)和水果產(chǎn)量造成了巨大的影響[1-2]。目前，我國(guó)輪紋病害的防治主要是依靠化學(xué)農(nóng)藥，而化學(xué)農(nóng)藥的大量使用和濫用導(dǎo)致了環(huán)境污染、生態(tài)多樣性破壞、農(nóng)藥殘留及植物病原菌產(chǎn)生耐藥性等一系列難題[3]。開(kāi)發(fā)利用新型生物農(nóng)藥可彌補(bǔ)化學(xué)農(nóng)藥的不足，微生物制劑用于植物病害的防治受到了廣泛的重視[4-5]。芽孢菌屬繁殖力強(qiáng)，其芽孢可在惡劣環(huán)境中存活，并且其產(chǎn)生的細(xì)菌素、抗菌蛋白、脂肽類抗生素等產(chǎn)物具有抑菌作用，被廣泛地應(yīng)用于微生物菌劑的研制[6-8]。用于植物病害防治的微生物菌株主要來(lái)源于陸地和海洋，其中來(lái)源于陸地的生物菌株開(kāi)發(fā)應(yīng)用比較普遍，而來(lái)源于海洋的微生物菌株，由于海洋特殊的生態(tài)環(huán)境，如高壓、高鹽、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)等，造就了其產(chǎn)物的特異結(jié)構(gòu)和活性是陸源微生物無(wú)法比擬的[9-11]。很多海源微生物的次生代謝產(chǎn)物對(duì)植物病害的防效更好，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

本課題組從連云港海域分離獲得1株對(duì)輪紋病等多種植物病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04菌株。為了進(jìn)一步了解該菌株特性，筆者系統(tǒng)研究了該菌株及其發(fā)酵液的抑菌譜以及對(duì)仁果類輪紋病病害的防效，旨在為該菌株后續(xù)開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株、培養(yǎng)基及果實(shí)來(lái)源

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04由江蘇海洋大學(xué)海洋微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存。供試植物病原真菌（表1）和細(xì)菌保存在該實(shí)驗(yàn)室。

PDA馬鈴薯培養(yǎng)基；PD液體培養(yǎng)基；NA液體培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮1.0%，花生餅粉1.0%，CaCl21.0%，pH 7.5。

梨：市售雪梨；蘋(píng)果：市售紅富士。

1.2 BMF 04菌株及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)植物病原真菌抑菌作用的測(cè)定

將4℃下保存的BMF 04菌株在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，在28℃的條件下培養(yǎng)1 d進(jìn)行活化；將4℃下保存的植物病原真菌在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)接于PDA平板上，在28℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行活化，備用。

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，在PDA平板中央接種直徑為7 mm的病原真菌菌苔，在真菌三邊距培養(yǎng)皿邊緣25 mm處劃線接種活化1 d的BMF 04菌株，以不接BMF 04菌株作為對(duì)照，3次重復(fù)。28℃培養(yǎng)3～5 d，觀測(cè)并測(cè)量抑菌帶寬度。

表1 BMF 04 菌株及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)不同植物病原真菌的抑制作用測(cè)定結(jié)果

將甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04接種于PDA斜面，在溫度為28℃條件下，培養(yǎng)16 h，用PD培養(yǎng)基洗下，制成菌懸液，接入裝有60 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)16 h，得到種子液，調(diào)整種子液濃度為108CFU/mL。按照10%的接種量，將種子液接種裝入盛有60 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中；在溫度為28℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液冷卻至4℃，以10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾去除菌體，即為無(wú)菌發(fā)酵液。

采用牛津杯法，將植物病原真菌接在直徑90 mm的平板中央，在距邊緣25 mm處對(duì)稱放置4個(gè)牛津杯，3個(gè)牛津杯中各加入無(wú)菌發(fā)酵液200 μL，以發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，重復(fù)3次。28℃下恒溫培養(yǎng)4 d后，觀察植物病原真菌的生長(zhǎng)情況，并測(cè)量其抑菌帶寬度。

1.3 BMF 04菌株發(fā)酵液對(duì)不同細(xì)菌抑制作用的測(cè)定

采用牛津杯法，將斜面培養(yǎng)24 h的5種供試細(xì)菌接種至盛有60 mL NA液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，制成濃度為106CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌懸液均勻涂布在NA平板上，每個(gè)涂菌平板上等距離擺放4個(gè)牛津杯。牛津杯中加入200 μL BMF 04菌株的無(wú)菌發(fā)酵液，以等量的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，28℃下培養(yǎng)36 h，測(cè)定抑菌帶寬度，重復(fù)3次。

1.4 BMF 04菌株發(fā)酵液及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果果實(shí)輪紋病防治作用的測(cè)定

蘋(píng)果、梨果實(shí)表面的處理:選擇健康果形大小一致的蘋(píng)果和梨的果實(shí)，對(duì)其表面消毒后，在果實(shí)的赤道處打直徑為7 mm、深度為3 mm的傷口，每個(gè)果實(shí)3個(gè)傷口。用2種不同處理方法分別測(cè)定BMF 04菌株發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液的保護(hù)作用和治療作用。

保護(hù)作用：在傷口處分別用濃度為108CFU/mL BMF 04發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液100 μL處理，以等量的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，16 h接種蘋(píng)果輪紋病菌菌苔。

治療作用：在果實(shí)傷口處接種輪紋病菌菌苔，16 h后分別接種濃度為108CFU/mL BMF 04發(fā)酵液、無(wú)菌發(fā)酵液100 μL。

將不同處理的果實(shí)放入相對(duì)濕度為95%左右、28℃的恒溫培養(yǎng)箱中，觀察5～7 d，采用十字交叉法測(cè)量病斑直徑。每個(gè)處理設(shè)3重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)果實(shí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BMF 04菌株及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖1可見(jiàn)，BMF 04菌株對(duì)供試的26種植物病原真菌絲生長(zhǎng)均具有明顯的抑制作用，對(duì)23種真菌的抑菌帶寬度達(dá)18 mm以上，其中對(duì)芒果炭疽病菌抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為28.67 mm，其次是小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、番茄早疫病菌，抑菌帶寬度均超過(guò)27 mm。

圖1 BMF 04 菌株對(duì)不同植物病原真菌的抑制作用

從表1和圖2可見(jiàn)，BMF 04菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)供試的植物病原真菌均有抑制作用，對(duì)24種真菌的抑菌帶寬度在10 mm以上，其中對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，對(duì)水稻胡麻斑病菌和馬鈴薯晚疫病菌抑菌作用最弱，抑菌帶寬度分別為6.67 mm和4.67 mm。

圖2 BMF 04 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)不同病原真菌的抑制作用

2.2 BMF 04菌株發(fā)酵液對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用

從表2和圖3可知，BMF 04菌株對(duì)供試的金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度為20.55 mm，其次是青枯病菌，抑菌帶寬度為11.83 mm，對(duì)大腸桿菌、角斑病菌和枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑制作用。

表2 BMF 04 菌株無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用

圖3 BMF 04 菌株對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用

2.3 BMF 04菌株發(fā)酵液及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果果實(shí)輪紋病防治作用

從表3可見(jiàn)，經(jīng)BMF 04菌株發(fā)酵液處理過(guò)的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為21.03、18.03 mm，經(jīng)無(wú)菌發(fā)酵液處理過(guò)的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為24.60、22.60 mm，無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為43.10、53.87 mm；BMF 04菌株發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果的保護(hù)作用分別為61.15%、76.47%，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果的保護(hù)作用分別為51.24%、66.72%。以上結(jié)果表明，BMF 04菌株發(fā)酵液的抑菌作用明顯優(yōu)于無(wú)菌發(fā)酵液；BMF 04菌株對(duì)蘋(píng)果和梨具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，且對(duì)蘋(píng)果果實(shí)輪紋病的保護(hù)效果優(yōu)于梨果實(shí)上輪紋病的保護(hù)效果。

從表4可知，先接種輪紋病菌，后接種BMF 04菌株發(fā)酵液的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為29.03、32.13mm，接種無(wú)菌發(fā)酵液的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為34.17、36.77 mm，無(wú)菌發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組的梨、蘋(píng)果輪紋病病斑直徑分別為44.53、59.10 mm；BMF 04菌株發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果的治療作用分別為41.30%、51.77%，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果的治療作用分別為27.67%、42.88%。以上結(jié)果表明，BMF 04菌株發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果、梨輪紋病具有較好的治療作用，且對(duì)蘋(píng)果果實(shí)輪紋病的治療效果優(yōu)于梨果實(shí)上輪紋病的治療效果。

對(duì)比表3和表4可以看出，海洋細(xì)菌BMF 04菌株發(fā)酵液及其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果、梨果實(shí)的輪紋病都具有良好的防效，且該菌株對(duì)果實(shí)的保護(hù)效果優(yōu)于治療效果。

表3 BMF 04 菌株發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果果實(shí)輪紋病的保護(hù)作用

表4 BMF 04 菌株發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)梨、蘋(píng)果果實(shí)輪紋病的治療作用

3 結(jié)論與討論

甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04菌株及其發(fā)酵液對(duì)供試的26種植物病原真菌和2種細(xì)菌均具有抑制作用，該菌株對(duì)23種真菌的抑菌帶寬度達(dá)到了18 mm以上，無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)24種真菌的抑菌帶寬度達(dá)到了10 mm以上，其中對(duì)蘋(píng)果輪紋病菌和芒果炭疽病菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌帶寬度分別為23.50 mm和23.00 mm，說(shuō)明其抗菌譜較廣。目前，應(yīng)用于植物防病促生的芽孢菌屬主要為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等[12]，關(guān)于甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌在植物病害的防治應(yīng)用近年來(lái)也有所報(bào)道。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BAC-9912、WF-3對(duì)黃瓜灰霉病和炭疽病的防效分別達(dá)78.8%、77.38%[13-14]。從海洋中分離篩選的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌SHB114和BH21，能有效抑制黃瓜枯萎病、炭疽病、立枯絲核菌和葡萄灰霉病[15-16]。分離自天然餅肥發(fā)酵液的甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16菌株在香蕉根際土壤和植物體內(nèi)具有良好的定殖能力，是防治香蕉枯萎病的新菌種資源[17]。趙文珺等[18]室內(nèi)盆栽實(shí)驗(yàn)表明，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌NK、G-1對(duì)番茄白粉病防效分別達(dá)87.55%、47.74%，且能不同程度促進(jìn)番茄的生長(zhǎng)。本研究中的BMF 04菌株與上述報(bào)道的菌株相比抗菌譜較廣，抗菌種類也有明顯不同。該菌株的發(fā)酵液和無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)蘋(píng)果和梨的輪紋病均具有防治作用，且保護(hù)效果優(yōu)于治療效果，發(fā)酵液的防效優(yōu)于無(wú)菌發(fā)酵液的防效，對(duì)蘋(píng)果的保護(hù)效果及治療效果分別為76.47%、51.77%。

本研究說(shuō)明甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌BMF 04是一株具有廣譜抗菌性的海洋細(xì)菌，對(duì)果實(shí)輪紋病具有良好的防效，在植物病害的微生物防治方面具有廣泛的應(yīng)用前景。