梁 鵬，王劍瑞，崔大方

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

益智(Alpinia oxyphylla)為姜科(Zingiberaceae)山姜屬(Alpinia)多年生草本植物[1]，主產(chǎn)海南、廣東、廣西、福建，云南有少量種植[2]，其藥用部位為干燥成熟果實(shí)[3]，性溫味辛，主要用于治療尿頻、崩漏、嘔吐等癥[4]。現(xiàn)代藥理及臨床醫(yī)學(xué)研究表明，益智仁含揮發(fā)油(主要成分為桉油精、姜烯、姜醇等倍半萜類)、益智仁酮、維生素 B1、維生素 B2、維生素C、維生素E及多種氨基酸、脂肪酸等[5—8]，具有多種重要的藥理活性，包括抗衰老、抗癡呆、抗過敏、抗癌以及鎮(zhèn)靜催眠等[9—14]。

近年來，我國對益智做了大量研究工作，在栽培方面取得了一定進(jìn)展[15—19]。益智的繁殖一般有種子繁殖[20]和分株繁殖[21]。益智種子為頑拗性種子[22]，極易失水，不利于長時間保存，且發(fā)芽率低，發(fā)芽不集中，發(fā)芽時間長，對良種篩選造成一定的困難。邱燕連等[23]關(guān)于益智種子萌發(fā)和貯藏特性的研究表明，利用 300～700 mg·L-1GA3和 25 mg·L-1NAA 處理，或?qū)舴N子在室溫下放置10～20 d后播種，能縮短種子萌發(fā)時間，使種子發(fā)芽整齊，提高發(fā)芽率，但仍然存在發(fā)芽不集中、發(fā)芽率提高不明顯及植物生長調(diào)節(jié)劑處理濃度不精確等問題。因此，本研究旨在探索益智種子的貯藏特性，及催芽試劑對益智種子萌發(fā)的影響，以確定益智種子的最佳催芽方法及貯藏條件，為益智大規(guī)模種子繁殖及其優(yōu)良品種選育提供便利。

1 材料與方法

1.1 材料

益智果實(shí)于 2016年 7月采自廣東湛江三嶺山(以下稱廣東產(chǎn))、廣西玉林沙田林場(以下稱廣西產(chǎn))、海南五指山(以下稱海南產(chǎn))三個種源地，每種源地采集1 kg。果實(shí)呈黃色，種子基本成熟。

1.2 方法

1.2.1 種子含水量及千粒重測定

根據(jù)國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程(GB/T3543.6)[24]，采用低恒溫烘干法測定種子含水量。隨機(jī)取三種源地益智飽滿種子，放入研缽研磨，分別稱取2 g放入鋁盒中，每個樣品重復(fù)3次。置于烘箱中(103±2) ℃烘16 h后取出，置于干燥器中冷卻，稱量。含水量=(鮮重-干重)/鮮重×100%。

種子千粒重采用種子百粒重的方法測定，分別隨機(jī)取不同產(chǎn)地益智種子1000粒，分10個重復(fù)，每重復(fù)100粒，稱量后取平均值。

1.2.2 種子活力測定

隨機(jī)選取廣東產(chǎn)益智種子900粒，分成兩組，每組3份，每份150粒，第一組放入含水量10%濕沙培養(yǎng)皿中，第二組放入干燥空培養(yǎng)皿中，然后分別貯存在3種不同的環(huán)境中：冰箱冷凍貯存(-5 ℃～-3 ℃)、冰箱低溫貯存(2 ℃～3 ℃)、常溫貯存(23 ℃～25 ℃)。每處理每隔30 d，取10粒種子，利用2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法測定種子活力，重復(fù)3次[25]。以沸水浴煮10 min的種子為對照組。觀察樣品的染色情況。然后將樣品放入研缽中研磨，用60%乙醇溶解樣品，將研磨液倒入100 mL容量瓶定容，搖勻。于7200 r·min-1離心10 min。取上清液于分光光度計(jì)490 nm處測定吸光度，用于評價種子活力。

1.2.3 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

采用三因素四水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察產(chǎn)地、溫度、浸泡時間對益智種子發(fā)芽的影響(表1)。分別取三個種源地種子用KMnO4消毒后晾干，放入墊有雙層濾紙的玻璃培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每處理50粒種子，每處理重復(fù)3次，保持濾紙全天濕潤，以不浸泡、常溫培養(yǎng)種子為對照(CK)。種子發(fā)芽以肉眼可見為準(zhǔn)。記錄發(fā)芽率(正常發(fā)芽種子占供試種子數(shù)百分比)和發(fā)芽勢(發(fā)芽初始日至30 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)占供試種子數(shù)百分比)。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of soaking treatment orthogonal test

1.2.4 不同生長調(diào)節(jié)劑處理種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

利用不同生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、NAA、GA3)、不同濃度(100、300、500 mg·L-1)處理不同產(chǎn)地種子，按照1.2.3的方法進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)(表2)。每處理50粒種子，重復(fù)3次。以清水浸泡24 h、30 ℃條件下培養(yǎng)種子為對照(CK)。記錄發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

表2 正交試驗(yàn)因素及水平Table 2 Factors and levels of hormone treatment orthogonal test

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析、多因素分析、DUNCAN多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子千粒重與含水量

測得廣西產(chǎn)益智種子含水量 22.06%、千粒重20.08 g，海南產(chǎn)益智種子含水量 21.86%、千粒重19.03 g，廣東產(chǎn)益智種子含水量 21.72%、千粒重18.82 g。

2.2 不同貯存方式對種子活力的影響

利用TTC染色法測定種子活力，種胚染色越深則種子活力越大。統(tǒng)計(jì)顯示，益智種子貯存方式不同，其活力差異顯著(表3)。在保濕環(huán)境下貯存的各組種子染紅數(shù)均多于在干燥環(huán)境下相同溫度貯存的各組種子染紅數(shù)，但各組種子染紅數(shù)均隨貯存時間延長而減少。

在干燥條件下，低溫貯存30 d時，種子活力最高，種子染紅數(shù)為 8.00；常溫貯存次之，種子染紅數(shù)為 7.67；冷凍貯存種子活力最低，種子染紅數(shù)為4.67。貯存60 d時，常溫組種子活力顯著降低，種子染紅數(shù)為4.67；冷凍組種子染紅數(shù)降低為3.67；低溫組種子活力稍降低，種子染紅數(shù)維持在 7.67。貯存90d時，低溫組種子活力顯著降低，染紅數(shù)為3.67；而常溫組與冷凍組種子活力不足 20%。貯存120 d時，常溫組與冷凍組種子活力均為0；低溫組種子仍有活力，但種子染紅數(shù)僅 1.33。貯存 150 d時，所有處理種子全部失活。

表3 不同貯存方式的廣東產(chǎn)益智種子活力比較Table 3 Vigor of Alpinia oxyphylla seeds from Guangdong Province under different storage conditions

表4 不同溫度與不同浸泡時間處理種子發(fā)芽結(jié)果Table 4 Seed germination results treated with different temperature and soaking time

在濕潤條件下，低溫貯存30 d時，種子活力最高，種子染紅數(shù)為 8.67；常溫貯存次之，種子染紅數(shù)為 8.33；冷凍貯存種子活力最低，種子染紅數(shù)為5.33。貯存60 d和90 d時，常溫組與冷凍組種子活力顯著降低；而低溫組種子活力仍保持穩(wěn)定，種子染紅數(shù)保持在8.33。貯存120 d時，低溫組種子活力稍降低，種子染紅數(shù)為 7.33；而常溫組與冷凍組種子染紅數(shù)不足1，種子活力接近0；貯存150 d時，常溫組與冷凍組種子全部失活；低溫組種子仍有活力，種子染紅數(shù)為5.33。

綜上所述，益智種子在低溫濕潤環(huán)境中可保存較長時間，其最適宜的保存方式為保濕低溫貯存。

2.3 不同溫度與不同浸泡時間對種子發(fā)芽的影響

不同種源地、浸泡溫度和時間對益智種子萌發(fā)影響的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，處理組A1B2C3的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均最高，分別為58.00%和57.33%。采用直觀分析直接得出各因素的主次順序(表5)，極差(R)越大，表明該因素對試驗(yàn)結(jié)果影響越大，該因素也就越重要；反之亦然。極差分析顯示，益智種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢的影響因素順序?yàn)榻轀囟?B)>浸泡時間(C)>種源地(A)，即浸泡溫度(B)是影響益智種子發(fā)芽率(R=52.17)和發(fā)芽勢(R=38.66)的關(guān)鍵因子，其次是浸泡時間(C)，種源地(A)對發(fā)芽率(R=2.00)和發(fā)芽勢(R=6.50)的影響最小。

表5 不同浸泡處理對益智種子萌發(fā)指標(biāo)分析Table 5 Visual analysis of different soaking treatments on germination results

方差分析表明(表 6)，A、B、C因素對益智種子發(fā)芽率的影響極顯著(P<0.01)； B因素對益智種子發(fā)芽勢的影響極顯著(P<0.01)，種源地(A)和浸泡時間(C)對益智種子發(fā)芽勢的影響差異顯著，但浸泡時間對益智種子發(fā)芽勢的影響大于種源地的影響。

參試因素對發(fā)芽率和發(fā)芽勢的最優(yōu)水平處理組合為A1B2C3，即種源地為廣東，浸泡溫度30 ℃，浸泡時間24 h，與正交試驗(yàn)結(jié)果相一致。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及其濃度對種子發(fā)芽的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理益智種子的正交試驗(yàn)見表 6。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差和方差分析，根據(jù)極差值(R)判斷，影響益智種子發(fā)芽因素的順序?yàn)樯L調(diào)節(jié)劑種類(B)>生長調(diào)節(jié)劑濃度(C)>種源地(A)，即生長調(diào)節(jié)劑種類(B)對益智種子發(fā)芽率(R=20.00)和發(fā)芽勢(R=16.22)的影響最大，其次為生長調(diào)節(jié)劑濃度(C)，種源地(A)的影響相對較小。

方差分析表明(表 7)，處理組A1B3C3的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均最高，分別為88.67%和44.00%。對于發(fā)芽率而言，B、C因素的 P<0.01，說明生長調(diào)節(jié)劑種類(B)和生長調(diào)節(jié)劑濃度(C)對益智種子發(fā)芽率的影響極顯著，A因素的P<0.05，說明種源地(A)對益智種子發(fā)芽率的影響顯著；從發(fā)芽勢來看，生長調(diào)節(jié)劑種類(B)因素對益智種子發(fā)芽勢的影響極顯著(P<0.01)，生長調(diào)節(jié)劑濃度(C)對益智種子發(fā)芽率的影響顯著(P<0.05)；而種源地(A)對益智種子發(fā)芽勢的影響不顯著(P>0.05)。

綜合極差分析和方差分析結(jié)果，參試因素對發(fā)芽率和發(fā)芽勢的最優(yōu)水平處理組合為 A1B3C3，即種源地為廣東，赤霉素(GA3)濃度為500 mg·L-1。

表6 不同生長調(diào)節(jié)劑處理益智種子發(fā)芽正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Germination test results of different hormone treatments

表7 不同生長調(diào)節(jié)劑處理對益智種子發(fā)芽的極差和方差分析Table 7 Visual analysis of different hormone treatments on germination results

3 討論

3.1 貯存方式對益智種子活力的影響

本實(shí)驗(yàn)將益智種子分干藏和濕藏兩組并分別放置于常溫、低溫和冷凍三種環(huán)境下貯存，濕藏組種子活力明顯高于干藏組，表明水分對益智種子活力具有影響。貯存于低溫條件的種子活力最高，而冷凍條件的種子活力與對照組種子幾乎相同，這與頑拗性種子對低溫較敏感的觀點(diǎn)一致。

益智種子屬頑拗性種子，種子活力與含水量有密切關(guān)系。益智種子成熟時種子含水量為20%左右，在采摘10 d后益智種子將嚴(yán)重失水。益智種子難于常規(guī)長期保存，短期的保存條件為低溫(2～3 ℃)保濕貯存＞低溫貯存＞常溫保濕貯存＞常溫貯存＞冷凍(-5～-3℃)保濕貯存＞冷凍貯存，在低溫保濕條件下其貯存時間可長至150 d，種子活力仍然大于50%。

3.2 不同因素對益智種子發(fā)芽的影響

環(huán)境溫度過高或者過低均會影響植物種子活力和種子萌發(fā)，適宜的溫水浸泡有利種子的破眠及萌發(fā)[26]。浸種實(shí)驗(yàn)表明，各參試因素對益智種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的影響顯著，溫度對益智種子萌發(fā)的影響最大，其次是浸泡時間，種源地對其萌發(fā)影響最小。不同植物種子對萌發(fā)溫度的要求不同，種子的萌發(fā)溫度與其具體生境密切相關(guān)。30 ℃是益智種子萌發(fā)的最適溫度，24 h為最適浸種時間，該溫度可有效促進(jìn)其種皮軟化，增強(qiáng)吸水能力，種子內(nèi)相關(guān)水解酶活性較高，從而更好地促進(jìn)種子萌發(fā)[27]。本實(shí)驗(yàn)中，益智種子在15 ℃時就可萌發(fā)，在30 ℃時萌發(fā)率最高，45 ℃時萌發(fā)率下降，60 ℃時種子全部失活，這可能是由于較高的溫度環(huán)境對種胚造成一定的傷害，以至種子死亡，最終導(dǎo)致發(fā)芽率及發(fā)芽勢下降。

GA3、6-BA 和 NAA 是常用的種子萌發(fā)催芽生長調(diào)節(jié)劑，不同種子對不同類型植物生長調(diào)節(jié)劑和濃度的反應(yīng)不一。研究表明，生長調(diào)節(jié)劑種類對益智種子萌發(fā)的影響最大，其次是生長調(diào)節(jié)劑濃度，種源地對其萌發(fā)影響最小。其中，經(jīng)不同質(zhì)量濃度GA3處理的種子發(fā)芽率最高，NAA次之，經(jīng) 6-BA處理的種子發(fā)芽率最低。種子的休眠和萌發(fā)實(shí)際是萌發(fā)抑制物ABA與萌發(fā)促進(jìn)物GA3相互競爭的結(jié)果。GA3在種子萌發(fā)過程中與ABA互為拮抗關(guān)系，通過提高各種酶活性加速種子內(nèi)部物質(zhì)的分解與合成，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)[28]。適宜于益智種子萌發(fā)的生長調(diào)節(jié)劑浸種條件為500 mg·L-1GA3處理，這與邱燕連等[23]的報道相似。