劉芷兮，陳 燕，肖洪濤，2△

(1.四川省腫瘤醫(yī)院·研究所、四川省癌癥防治中心，臨床藥學(xué)部；電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

I型神經(jīng)纖維瘤病 (neurofibromatosis type 1)是常染色體顯性遺傳病，每3000個(gè)新生兒中就有1個(gè)患兒，其致病基因位于常染色體17q11.2。它是由腫瘤抑制基因NF1突變引起的，NF1基因在17q11.2處有一個(gè)大基因座(350 kbp)，它包含61個(gè)外顯子，其中含有4個(gè)交替拼接的外顯子，轉(zhuǎn)錄后大小為12 kbp信使RNA(mRNA)，其中包含8454個(gè)核苷酸的開(kāi)放閱讀框[1]。該基因編碼ras信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，突變主要影響神經(jīng)嵴衍生組織類型(如雪旺細(xì)胞和黑素細(xì)胞)[2]。外顯率為100%，其中的大部分患者，為散發(fā)式病例，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，且涉及多個(gè)系統(tǒng)[3]?；加蠳F1的兒童和成人出現(xiàn)包括良性和惡性腫瘤在內(nèi)的疾病，包括認(rèn)知缺陷、癲癇發(fā)作、生長(zhǎng)異常、周?chē)窠?jīng)病變和以咖啡色斑點(diǎn)和輔助雀斑的形式出現(xiàn)的異常色素沉著。神經(jīng)系統(tǒng)也會(huì)出現(xiàn)并發(fā)癥，如不受控制的偏頭痛等[4]。

1982年，神經(jīng)纖維瘤病被分為7類[5]，NF1也稱馮雷克豪森氏病，占神經(jīng)纖維瘤病的85%以上也是本文主要的研究對(duì)象。NF2為聽(tīng)神經(jīng)鞘瘤病，與NF2基因失活有關(guān)，有顱內(nèi)腫瘤，一般表現(xiàn)為頭暈，耳鳴，視力下降，癥狀存在時(shí)間可數(shù)月至數(shù)年不等。NF3為混合型神經(jīng)纖維瘤病，具有NF1與NF2兩種表征。NF4為變異型神經(jīng)纖維瘤病。NF5為節(jié)段型神經(jīng)纖維瘤病(segmental neurofibromatosis，SNF)。NF6是僅有牛奶咖啡斑型神經(jīng)纖維瘤病，NF7為遲發(fā)型神經(jīng)纖維瘤病，發(fā)病在30歲以后[6]。

闡明NF1基因突變的類型，對(duì)于涉及相關(guān)疾病的基礎(chǔ)和臨床研究具有重要的意義，本文主要聚焦NF1的突變及相關(guān)表型，NF1基因突變無(wú)規(guī)則無(wú)序，總結(jié)NF1突變包括以下多種類型：染色體畸變、多個(gè)外顯子缺失、大插入、終止突變(無(wú)義突變)、氨基酸替代、內(nèi)含子突變及3’ 端非翻譯區(qū)突變等，新發(fā)突變高，且無(wú)明顯熱點(diǎn)突變。其中體細(xì)胞傾向于缺失，而生殖細(xì)胞傾向于點(diǎn)突變。

1 突變類型

1.1 錯(cuò)義突變錯(cuò)義突變通常是指編碼某一種的氨基酸的密碼子由于錯(cuò)誤的堿基互補(bǔ)配造成氨基酸的改變，致使蛋白質(zhì)喪失原有的功能與結(jié)構(gòu)。柳州市婦幼保健院日前，對(duì)一例先證者為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病的患兒進(jìn)行基因突變鑒定與家系研究。該患兒女，8歲，生后即有神經(jīng)纖維瘤典型體征，軀干與四肢牛奶咖啡斑，2歲超聲顯示，左眼眶周腫塊等。使用高通量測(cè)序與sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)該患兒NF1基因c.1013 A>G雜合變異，該變異導(dǎo)致第338號(hào)氨基酸由天冬氨酸變?yōu)楦拾彼?(Asp變?yōu)镚ly)，為錯(cuò)義突變，患兒生物學(xué)父母該位點(diǎn)未見(jiàn)異常，分析為散發(fā)的錯(cuò)義突變[3]。

1.2 無(wú)義突變無(wú)義突變通常是指因?yàn)镈NA的突變提前出現(xiàn)終止密碼子導(dǎo)致，使多肽鏈合成中斷，形成一段無(wú)意義的蛋白。重慶醫(yī)科大學(xué)17年報(bào)道了一例NF1無(wú)義突變的病例。患兒女(先證者)，11歲。軀干及四肢見(jiàn)散在牛奶咖啡斑、腋窩雀斑及皮膚神經(jīng)纖維瘤。患兒家族中有類似疾病史，臨床診斷為Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)?；驕y(cè)序明確突變位點(diǎn)為NF1基因c.2351 g>A，該突變是第一次在NF1基因中報(bào)道。先證者母親幼兒時(shí)也有Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤體征，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒母親與患兒攜帶相同突變。國(guó)際人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)還未檢索到該突變[7]。

湖南航天醫(yī)院皮膚科報(bào)告1例I型神經(jīng)纖維瘤家系并進(jìn)行基因突變的檢測(cè)。先證者男，5歲，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，先證者NF1基因的第2 620位堿基出現(xiàn)A/T雜合突變(c.2620 A >T)，致874位密碼子由原來(lái)編碼賴氨酸(Lys) 的AAG突變?yōu)門(mén)AG，形成提前終止密碼子，故造成蛋白截?cái)?。而先證者的父親、祖母中也存在相同的突變，在(HGMD)中也尚未見(jiàn)此突變報(bào)告[8]。

1.3 基因大片段缺失與剪切突變北京協(xié)和醫(yī)院在2016年分析了8例Ⅰ神經(jīng)纖維瘤的病例，8例患兒就有7種突變的形式。其中兩例為NF1基因全部缺失，一例為基因的剪切突變c.3975-2delA(成熟RNA中含有內(nèi)含子或缺失外顯子序列的一類突變。)一例無(wú)義突變c.3721 C>T，p.R 1241 X。另外5名患者分別為四種突變則為c.49744977delCTAT，p.Y1659 TfsX17、c.39873988delAG，p.S1329fsX4、c.1511delC，p.P504QfsX22和c.6388delC，p.L2130fsX3[9]。

1.4 移碼突變(缺失突變)2014年，中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志刊登了NF1基因突變突變檢測(cè)的一篇文章，該兩名患者均有NF1典型體征，出生時(shí)軀干和四肢有咖啡牛奶斑，隨著年齡增長(zhǎng)不斷擴(kuò)大，但兩者聽(tīng)力視力智力均正常。文章就這兩名患者進(jìn)行sanger測(cè)序，其中一位患者測(cè)序結(jié)果為27號(hào)外顯子存在c.3691delA移碼突變(p.R1207DfsX8)[10]。安徽醫(yī)科大學(xué)陳濱的碩士學(xué)位論文中報(bào)道了一位NF1基因無(wú)義突變的患者(c.3443-3444delCA)，20號(hào)外顯子第3443-3444位置的兩個(gè)堿基缺失，導(dǎo)致后續(xù)終止密碼TGA提前出現(xiàn)，形成截短蛋白[11]。移碼突變是指在DNA片段中丟失或插入一個(gè)或幾個(gè)堿基，可以不是三的倍數(shù)，引起遺傳信息的改變。

2 NF1缺失類型分類

根據(jù)Dorschner等的相關(guān)研究[12]，總的來(lái)說(shuō)可將NF1的缺失類型分為4大類(第1，2，3和非典型缺失)。1型缺失占所有大型NF1缺失的70～80%[13]，大多數(shù)1型NF1缺失是因?yàn)槁涯讣?xì)胞在減數(shù)分裂過(guò)程中，染色體間非等位基因同源重組(NAHR)造成的。NF1基因中的NAHR是由NF1-repa和NF1-repc所介導(dǎo)的低拷貝重復(fù)序列引起的。在這些低拷貝重復(fù)中，檢測(cè)到兩個(gè)NAHR熱點(diǎn)內(nèi)重復(fù)的斷點(diǎn)(recurrent breakpoints)，稱為同源重組位點(diǎn)1和2[14]。2型NF1缺失通常是由有絲分裂過(guò)程中的NAHR引起的，因此與體細(xì)胞位點(diǎn)缺失有關(guān)[15]。與1型NF1缺失相比，2型缺失與13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的半合子性相關(guān)。至少10%的大型NF1缺失屬于2型，也許還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止[16]。3型NF1缺失非常罕見(jiàn)，這些1.0 MB的缺失僅發(fā)生在所有NF1總?cè)笔Щ颊咧械?%～4%，并且是由NF1-repb和NF1-repc之間的NAHR介導(dǎo)引起的，導(dǎo)致總共9個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的半合子性。非典型的NF1缺失并不表現(xiàn)出重復(fù)的斷點(diǎn)，并且就其大小和位于缺失區(qū)域內(nèi)的基因數(shù)量是非常不同的。非典型NF1缺失不僅在其長(zhǎng)度上是高度異質(zhì)，而且就其潛在的突變機(jī)制而言，可能涉及異常DNA雙鏈斷裂修復(fù)或復(fù)制以及反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的機(jī)制[17]。

3 基因型與表型關(guān)系

迄今為止，僅鑒定了NF1中的少數(shù)的基因與表型的關(guān)系。其中之一是NF1基因第17外顯子中的三堿基對(duì)的缺失(c.2970-2972 delAAT)導(dǎo)致單個(gè)氨基酸(p.Met992del)的丟失，這種基因的改變與相對(duì)輕微的NF1表型相關(guān)，其特征是出現(xiàn)咖啡色斑(CALS)和皮褶雀斑，無(wú)外部可見(jiàn)的皮膚叢狀神經(jīng)纖維瘤[18]。另外NF1中與基因-表型相關(guān)的是密碼子p.Arg1809的錯(cuò)義突變，具有該特異性NF1突變的個(gè)體表現(xiàn)出CALS(可能有雀斑，可能無(wú))和Lisch結(jié)節(jié)，但沒(méi)有外部可見(jiàn)的叢狀神經(jīng)纖維瘤或皮膚神經(jīng)纖維瘤[19]。然而，密碼子p.arg1809的錯(cuò)義突變似乎非常罕見(jiàn)，因?yàn)樵?000名已識(shí)別突變的NF1患者隊(duì)列中，只有1.2%的患者觀察到錯(cuò)義突變。在同一組患者中，同一種氨基酸缺失(p.Met992del)的發(fā)生率為0.8%[20]。

4 NF1高表型變異性原因

為了解釋NF1的高表型變異性，科學(xué)家們給出了三類不同因素的作用。第一個(gè)因素是發(fā)生在NF1胚胎發(fā)育中或者更早(如父母體內(nèi)配子發(fā)生)的突變性質(zhì)。NF1中一個(gè)非常小的部分突變都與患者特定的體征有關(guān)，所以這表明，突變的性質(zhì)并不是關(guān)鍵的決定因素[21]。第二個(gè)因素描述了一些特定已知的神經(jīng)纖維瘤修飾物的存在，包括但不局限于遺傳因子、性激素和腫瘤微環(huán)境[22]。第三個(gè)因素發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的某一特定時(shí)間，與NF1基因的失活密切相關(guān)。NF1疾病患者只在他們身體的一小部分表現(xiàn)出來(lái)，最可能的解釋是體細(xì)胞嵌合體，第一個(gè)NF1突變發(fā)生在胚泡和成神經(jīng)細(xì)胞階段之間的胚胎發(fā)育后期，這樣一些細(xì)胞就可以存活下來(lái)，并保持NF1的野生型[23]。

5 NF1基因突變分析

NF1基因的突變率比大多數(shù)其他遺傳疾病基因高10倍左右[24]。目前，在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(HGMD)中，已有超過(guò)2600種不同的NF1遺傳突變點(diǎn)。被報(bào)道為是造成NF1疾病的原因，從跨越數(shù)個(gè)堿基大基因組的缺失到改變編碼氨基酸或剪接位點(diǎn)功能的單堿基對(duì)替換，其突變大小各不相同[25]。雖然NF1突變譜明確定義為錯(cuò)義/無(wú)義(27.7%)，剪接(16.3%)，微缺失(26.9%)，微插入(11.1%)，總?cè)笔?> 20 bp；13.3%)，總插入(> 20 bp；2.0%)，復(fù)雜重排(0.6%)等，但沒(méi)有證據(jù)表明NF1內(nèi)有任何局部的突變簇[26]。大多數(shù)(> 80%)的NF1突變后蛋白失活，基本會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的完全缺失。由于基因大小和結(jié)構(gòu)較大，以及突變范圍跨度大，患者中NF1突變的鑒定仍然很困難[27]。一直以來(lái)，使用互補(bǔ)組合方法鑒定了95%患者的基因突變位點(diǎn)，方法包括蛋白質(zhì)截?cái)鄬?shí)驗(yàn)，熒光原位雜交，異源雙鏈DNA，Southern印跡雜交和細(xì)胞遺傳學(xué)分析等[28]。一般初步的報(bào)告是通過(guò)測(cè)序檢測(cè)NF1患者的樣本，然后基于DNA的測(cè)序?yàn)榕R床診斷測(cè)試提供結(jié)論(見(jiàn)阿拉巴馬大學(xué)伯明翰醫(yī)學(xué)基因組實(shí)驗(yàn)室的網(wǎng)站)。因此，NF1突變分析有助于在臨床中診斷不確定的NF1的病例[29]。

6 討論

NF1基因突變類型及表型的闡明，可為下一步的研究奠定基礎(chǔ)，伴隨著新的基因治療手段和方法的出現(xiàn)，對(duì)于由NF1突變導(dǎo)致的疾病，采取基因治療方法治療該類疾病提供支撐和依據(jù)。