馬歆茹，駱春梅，王沙沙，杜 芹

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563003；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610072；3.川北醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000；4.電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610054，5.中國科學(xué)院成都生物研究所，四川 成都 610041)

活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)分子家族的成員以一氧化氮為中心，包括過氧亞硝基陰離子(ONOO-)、亞硝酸根離子(NO2-)、硝?；庪x子(NO-)、二氧化氮(NO2)和三氧化二氮(N2O3)等[1]。RNS可以介導(dǎo)口腔中多種病理生理反應(yīng)。在生理情況下，RNS對(duì)維持口腔功能十分重要，如牙周組織中的NO可以擴(kuò)張牙周組織內(nèi)血管，增加局部血流，促進(jìn)傷口愈合及改善皮瓣存活[2]。而在病理狀態(tài)下，由感染等因素導(dǎo)致口腔中RNS顯著升高，此時(shí)RNS雖可作為宿主非特異性免疫重要的一部分有效抵抗外界感染，但濃度過高的RNS會(huì)導(dǎo)致硝化應(yīng)激，引起宿主細(xì)胞損傷或凋亡，介導(dǎo)或參與牙周炎、根尖周炎、扁平苔蘚和口腔癌等疾病。本文主要介紹口腔中RNS的構(gòu)成及其病理生理功能，探討RNS對(duì)口腔健康的雙重作用，為口腔疾病防治提供理論基礎(chǔ)。

1 口腔內(nèi)主要RNS的來源及作用機(jī)制

1.1 NONO廣泛存在于體內(nèi)各組織器官中，是一種具有生物活性的氣體信號(hào)分子，它作為親脂自由基可以通過擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜進(jìn)入胞質(zhì)[3]。體內(nèi)的NO可以通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)途徑和硝酸鹽-亞硝酸鹽-NO途徑產(chǎn)生，其中NOS途徑是產(chǎn)生內(nèi)源性NO的主要途徑。哺乳動(dòng)物的NOS主要由L-精氨酸的代謝產(chǎn)生，分三種類型，在組織中表達(dá)不同并通過適當(dāng)?shù)拇碳みx擇性激活，產(chǎn)生NO[4]。其中神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal NOS，nNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial NOS，eNOS)在短時(shí)內(nèi)只能產(chǎn)生少量的NO，主要起調(diào)節(jié)生理功能的作用，如參與平滑肌松弛、調(diào)節(jié)血管舒張以控制血壓、參與神經(jīng)元發(fā)育和神經(jīng)信號(hào)傳遞、參與組織穩(wěn)態(tài)、參與學(xué)習(xí)及記憶的過程以及抑制血小板聚集等[5]。但另一種NOS，誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS，iNOS)往往不在健康情況下表達(dá)，而在受γ-干擾素和脂多糖等細(xì)胞因子或微生物產(chǎn)物誘導(dǎo)后的巨噬細(xì)胞中表達(dá)。iNOS被轉(zhuǎn)錄激活后通過催化精氨酸，可在幾小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生大量的NO，這種過量的NO往往介導(dǎo)細(xì)胞毒性。

無論通過哪一種途徑合成，生物系統(tǒng)中的NO都可以通過兩種不同的信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用：環(huán)鳥苷3，5-單磷酸cGMP依賴性通路以及cGMP非依賴性通路。在前一種通路中，NO與可溶性鳥苷酸環(huán)化酶的血紅素基團(tuán)結(jié)合，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生cGMP以及活化蛋白激酶G，在神經(jīng)與血液系統(tǒng)中起信號(hào)傳導(dǎo)作用。而后一種通路則是通過對(duì)半胱氨酸硫醇的S-亞硝基化以及對(duì)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸的硝化，介導(dǎo)生物分子的化學(xué)修飾，引起細(xì)胞損傷。

1.2 ONOO-ONOO-由NO和超氧化物反應(yīng)而產(chǎn)生，在NO和超氧化物接近等摩爾比時(shí)其產(chǎn)量最大，是一種比NO更穩(wěn)定，且活性更強(qiáng)的氧化劑及硝化劑，是導(dǎo)致硝化應(yīng)激的主要成分。

生理?xiàng)l件下ONOO-的產(chǎn)量很低，起維持生理功能的作用。與NO介導(dǎo)的生理作用相似，ONOO-可作為信號(hào)分子參與信號(hào)傳導(dǎo)過程，如調(diào)節(jié)血管收縮及調(diào)節(jié)免疫功能。但在炎癥等病理情況下，細(xì)胞因子或微生物刺激吞噬細(xì)胞，生成過量的的超氧陰離子(O2-)和NO，且二者發(fā)生反應(yīng)生成大量的ONOO-。ONOO-能與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等大多數(shù)生物分子反應(yīng)，促進(jìn)生物分子氧化或硝化而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。例如，ONOO-可以硝化蛋白質(zhì)的酪氨?；纬上趸野彼幔^量的ONOO-可以導(dǎo)致硝基酪氨酸在體內(nèi)的積累，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與活性功能[8]。ONOO-還可以與鳥嘌呤快速反應(yīng)生成8-硝基鳥嘌呤，8-硝基鳥嘌呤有潛在的致突變作用和致癌的可能性，與腫瘤侵襲和癌癥患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。ONOO-介導(dǎo)的生物分子的修飾在多種疾病中起了重要的作用，包括高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血癥、膿毒癥、缺血再灌注損傷和神經(jīng)退行性疾病等全身疾病，以及牙周炎、口腔腫瘤和輻射誘導(dǎo)的唾液腺功能障礙等口腔疾病[9]。

高濃度的ONOO-對(duì)真核生物和原核生物都具有強(qiáng)于NO的細(xì)胞毒性。組織中長時(shí)間生成適量的ONOO-也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的大量氧化和潛在破壞，影響細(xì)胞功能及信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。除了損傷機(jī)體正常細(xì)胞外，ONOO-還能作為一種重要的抗菌劑發(fā)揮強(qiáng)于NO的微生物毒性作用，參與機(jī)體免疫。

1.3 NO2-體內(nèi)的NO2-有三種不同的來源。第一種來源是作為ONOO-等其他RNS在體內(nèi)分解生成的代謝產(chǎn)物。第二種來源是由硝酸鹽在體內(nèi)還原成亞硝酸鹽：當(dāng)人體食用含硝酸鹽的食物后，硝酸鹽經(jīng)唾液腺濃縮釋放進(jìn)入口腔，通過口腔內(nèi)硝酸鹽還原菌的作用將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[6]。第三種來源為膳食攝入的亞硝酸鹽。

NO2-能通過兩種途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。在缺氧和炎癥條件下NO2-含量升高，黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase，XOR)發(fā)揮NO2-還原酶功能，催化NO2-還原為NO發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。除了這種途徑外，在不依賴XOR的條件下，NO2-可以通過與血紅蛋白反應(yīng)，降低血紅蛋白還原NO的能力而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。但是NO2-也能通過衍生出多種RNS修飾生物分子，引起細(xì)胞損傷，或促進(jìn)N-亞硝胺(N-nitrosamines)的形成導(dǎo)致炎癥和癌癥等病理現(xiàn)象。

1.4 N2O3NO能在有氧環(huán)境下與氧分子反應(yīng)，自動(dòng)氧化為NO2及N2O3，而N2O3可以解離生成NO+和硝酸鹽?？谇晃h(huán)境中的NO能通過這種方式轉(zhuǎn)化為其他RNS。當(dāng)體內(nèi)NO的量遠(yuǎn)大于O2-時(shí)，NO與O2-反應(yīng)主要生成N2O3。當(dāng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞受γ-干擾素刺激后，可比受未刺激時(shí)多合成3～4倍的NO，這時(shí)NO與O2-反應(yīng)主要生成N2O3。N2O3不穩(wěn)定，它可以促進(jìn)硫與胺的亞硝化，生成S-亞硝基硫醇(S-nitrosothiols，RSNO)和N-亞硝胺。

2 口腔中RNS的生理作用

口腔中富含多種RNS，它們主要有兩個(gè)來源：由NOS產(chǎn)生的NO衍生或源于口腔微環(huán)境中硝酸鹽還原菌產(chǎn)生的NO2-。這些RNS不僅起調(diào)節(jié)和維持口腔生理功能的重要作用，還能在多種口腔硬軟組織疾病中發(fā)揮正面作用。

從表3可以看出，合金鋅粉加入量按照貧鎘液鈷的30倍加入，鋅粉消耗量大，除鈷效率不到20%，鎘也并未置換出來，并未有效地解決系統(tǒng)鈷循環(huán)、富集的問題。

2.1 抗菌RNS可以被機(jī)體的免疫系統(tǒng)用于防御感染，殺滅病原微生物。在機(jī)體遭受外界微生物的入侵后，微生物及其產(chǎn)物刺激巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活iNOS，在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量NO。NO可介導(dǎo)細(xì)胞毒性以殺傷微生物，它可以結(jié)合螯合鐵池生成二硝基-鐵絡(luò)合物(DNICs)抑制細(xì)菌功能，還能通過與ROS的反應(yīng)而增強(qiáng)其細(xì)胞毒性。外界微生物入侵后，吞噬細(xì)胞活化促進(jìn)NADPH氧化酶活性，通過呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的O2-。O2-不僅能在酸性條件下快速歧化生成H2O2發(fā)揮抗菌作用，還能與與NO反應(yīng)生成ONOO-發(fā)揮更強(qiáng)的抗菌作用?？谇粌?nèi)的RNS能作為機(jī)體抵抗病原菌的非特異性防御機(jī)制，如iNOS產(chǎn)生的NO可以控制牙齦卟啉單胞菌感染，抑制根尖周細(xì)菌從而控制牙槽骨吸收的進(jìn)展。而缺乏NO會(huì)加速牙槽骨的感染性吸收[10]。

在口腔中，硝酸鹽還原菌產(chǎn)生亞硝酸鹽也可以在齲病和牙周炎等口腔疾病中發(fā)揮抑菌作用。唾液中高濃度的硝酸鹽有助于齲病的預(yù)防，在變異鏈球菌和乳酸桿菌等致齲產(chǎn)酸菌導(dǎo)致的牙齒周圍的酸性環(huán)境中，亞硝酸鹽被快速質(zhì)子化形成亞硝酸，而不穩(wěn)定的亞硝酸會(huì)歧化形成以NO為主的一系列氮氧化物，起抑菌或殺菌作用[11]。另一方面，在食用富含硝酸鹽的食物后，唾液的PH會(huì)升高，抑制致齲菌的生長[12]。除預(yù)防齲病外，亞硝酸鹽也能在牙周炎和口念珠菌病等口腔炎癥疾病中發(fā)揮抗菌作用，炎癥狀態(tài)下唾液腺能分泌更高濃度的硝酸鹽，增加唾液的保護(hù)潛力。這種高濃度的硝酸鹽可由硝酸鹽還原菌還原為亞硝酸鹽，發(fā)揮抑菌作用[13]。

口腔中的亞硝酸鹽可隨唾液進(jìn)入酸性胃環(huán)境中而發(fā)揮抗菌作用，在一定程度上防止胃腸道疾病。此外，一些口腔微生物還能通過口腔中亞硝酸鹽在全身感染中發(fā)揮積極作用。副鰻鏈球菌及血鏈球菌等口腔共生鏈球菌在有氧條件下能主要通過丙酮酸氧化酶SpxB產(chǎn)生H2O2，H2O2與口腔中的亞硝酸鹽反應(yīng)形成ONOO-等RNS，抑制銅綠假單胞菌的生長，利于肺部囊性纖維化感染期間肺部功能的改善[14]。

2.2 調(diào)節(jié)血管舒張口腔中的亞硝酸鹽進(jìn)入體循環(huán)后，能轉(zhuǎn)化為NO等RNS發(fā)揮一些生理作用，體循環(huán)中的NO可以通過血管舒張發(fā)揮一定的降血壓作用，益于心血管健康。由于口腔內(nèi)硝酸鹽還原菌是產(chǎn)生亞硝酸鹽的一個(gè)重要來源，口腔微生物群的變化會(huì)引起NO含量變化，通過調(diào)節(jié)血管舒張影響血壓。因此，使用抗菌漱口水的人口腔微環(huán)境中及血漿中亞硝酸鹽含量減少，使收縮壓和舒張壓增高[15]。

口腔軟組織中NOS產(chǎn)生的NO通過調(diào)節(jié)口腔血流及唾液的流動(dòng)，維持著口腔的生理功能?？谇唤M織的血液循環(huán)受nNOS和eNOS合成的NO調(diào)節(jié)，對(duì)于維持口腔健康至關(guān)重要。例如，NO調(diào)節(jié)著牙齦中的血流灌注，使血管舒張并向遠(yuǎn)端擴(kuò)散，尤其是向根尖部血管擴(kuò)散，對(duì)皮瓣存活和傷口愈合起積極作用[2]。適量的NO維持牙周組織的健康，在早期牙周炎中，牙周組織中的NO通過舒張血管平滑肌調(diào)節(jié)局部血流，起改善微循環(huán)的作用。

2.3 控制口腔疾病的發(fā)展以NO為代表的RNS可以控制一些口腔疾病的發(fā)展。Korde等[16]的研究表明，口腔癌組織中的NO能通過抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮一定的抗腫瘤作用，并且iNOS的上調(diào)可能會(huì)抑制口腔癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和致瘤性。在牙周炎及根尖周炎中，NO控制著牙槽骨吸收的進(jìn)展，高濃度的外源性NO可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞祖細(xì)胞凋亡，抑制成熟破骨細(xì)胞的再吸收活性而抑制牙槽骨的吸收。

3 口腔中RNS的病理作用

口腔內(nèi)RNS除了發(fā)揮正面作用外也能導(dǎo)致多種病理狀態(tài)。例如，由微生物感染產(chǎn)生的RNS通過靶向微生物起抗菌作用，但RNS靶向的分子部位不僅是微生物，還包括了宿主，因此RNS也會(huì)損傷宿主細(xì)胞。這種由RNS引起的生物分子修飾會(huì)導(dǎo)致一些病理狀態(tài)，與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

3.1 促進(jìn)牙周炎的進(jìn)展許多研究證實(shí)了炎癥牙周組織中iNOS的活性及NO含量高于正常牙周組織，這是因?yàn)檠例l卟啉單胞菌、伴放線聚集桿菌和中間普氏菌等牙周致病菌能通過刺激巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)iNOS表達(dá)[5，7，9]，使局部持續(xù)產(chǎn)生大量NO和ONOO-，ONOO-與酪氨酸反應(yīng)生成硝基酪氨酸，導(dǎo)致牙周組織損傷。iNOS的表達(dá)及隨后生成的RNS促進(jìn)了牙周病的進(jìn)展，造成牙周局部組織的破壞、牙槽骨吸收。如由iNOS產(chǎn)生的NO不僅可以通過增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化和活性，還可以和ONOO-通過激活聚ADP-核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]介導(dǎo)下游組織毒性，導(dǎo)致牙槽骨吸收和牙周炎中血漿外滲[17，18]。

一些外源性因素或全身因素促進(jìn)了牙周炎中RNS的產(chǎn)生。例如，吸煙的牙齦炎患者的牙齦組織內(nèi)能檢測(cè)到較不吸煙的牙齦炎患者更強(qiáng)的iNOS表達(dá)，參與牙周病的發(fā)病機(jī)制[19]。患糖尿病的牙周炎大鼠的牙齦組織中ONOO-及硝基酪氨酸含量增高，提示糖尿病患者能通過硝化應(yīng)激加重牙周病的程度[20]。

3.2 促進(jìn)根尖周組織破壞來源于牙髓和根管系統(tǒng)的細(xì)菌感染導(dǎo)致根尖周聚集大量的免疫細(xì)胞，引起根尖周炎癥。各種急慢性根尖周炎患者的根尖周組織中都存在著大量表達(dá)iNOS的細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、多形核白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，使根尖周組織富含NO。與牙周炎中牙槽骨吸收相似，由iNOS產(chǎn)生的NO在炎癥狀態(tài)下促進(jìn)根尖周牙槽骨的吸收，并且NO與O2-反應(yīng)生成的ONOO-可導(dǎo)致根尖周組織的嚴(yán)重破壞。

3.3 促進(jìn)口腔癌的發(fā)生由RNS導(dǎo)致的硝化應(yīng)激是口腔癌發(fā)病的主要原因，RNS的增加導(dǎo)致唾液抗氧化系統(tǒng)的消耗減少，使氧化劑與抗氧化劑失衡，造成生物分子的氧化損傷，特別是NO介導(dǎo)生成的脂質(zhì)過氧化物——丙二醛、氧化蛋白質(zhì)和氧化DNA的形成與口腔癌的病理機(jī)制密切相關(guān)。許多研究表明，口腔癌患者唾液中RNS增加而抗氧化劑含量顯著減少，且類似的氧化劑——抗氧化劑失衡也發(fā)生在口腔癌患者癌組織中及血液中，提示口腔癌患者抗氧化防御機(jī)制減少而硝化應(yīng)激增加[21～23]。此外，口腔中硝酸鹽還原菌產(chǎn)生的亞硝酸鹽與胺和酰胺的反應(yīng)可生成N-亞硝胺，N-亞硝胺具有很高的致癌性和致突變性，也促進(jìn)了口腔癌的發(fā)生[21，22]。

3.4 參與口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展NO與口腔扁平苔蘚(orallichen planus，OLP)的發(fā)生發(fā)展有著緊密聯(lián)系。一些研究表明，OLP患者的唾液NO和亞硝酸鹽明顯增高，這可能是由于炎癥狀況而導(dǎo)致iNOS的過表達(dá)，產(chǎn)生了更多的NO，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在OLP的組織病理學(xué)中被視為基底細(xì)胞變性[24，25]。盡管NO在OLP的發(fā)病機(jī)制中的具體作用尚不明確，但對(duì)唾液NO的測(cè)定可能對(duì)扁平苔蘚的診斷、監(jiān)測(cè)及治療有一定意義。

3.5 參與Sj?gren綜合征的進(jìn)展NO的產(chǎn)生也與Sj?gren綜合征密切相關(guān)。Benchabane等[26]的研究表明，由于IL-6和IL-17 A等炎性因子的存在，Sj?gren綜合征患者唾液腺組織中的iNOS被激活而產(chǎn)生過量NO，而過量的NO可能導(dǎo)致唾液腺炎性損傷和腺泡細(xì)胞萎縮。

3.6 促進(jìn)唾液腺功能障礙的發(fā)生外源性輻射能促進(jìn)體內(nèi)RNS和ROS產(chǎn)生，引起一系列疾病。頭頸部惡性腫瘤的患者在接受放射治療后，唾液腺組織中會(huì)產(chǎn)生大量的NO與O2-，二者反應(yīng)生成ONOO-造成生物分子的損傷，使這些患者易患口干癥。輻射后產(chǎn)生的RNS可能是輻射誘導(dǎo)的唾液腺功能障礙的重要致病因素。

4 結(jié)語

RNS是近年來學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，口腔中富含多種RNS，發(fā)揮著多種病理生理作用。在正常生理情況下，RNS維持著口腔的正常生理功能，而在一些病理狀態(tài)下，由于RNS的含量上升或機(jī)體抗氧化系統(tǒng)障礙，導(dǎo)致了硝化應(yīng)激。RNS與多種口腔疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，RNS能在口腔疾病中發(fā)揮一定的正面作用：RNS可以在口腔感染性疾病中發(fā)揮抑菌作用、控制一些口腔疾病的進(jìn)展以及用于口腔疾病的治療。RNS在口腔疾病的治療方面展現(xiàn)出一定的臨床應(yīng)用前景：NO可作為治療一些口腔疾病的靶標(biāo)，抑制NO或使NO過量產(chǎn)生可以作為口腔疾病的治療策略，如使用iNOS選擇性抑制劑可以加速根尖周病的愈合[27]，使用外源性NO能抑制OSCC癌細(xì)胞的增值[28]。但過量的RNS也是導(dǎo)致或促進(jìn)多種口腔疾病的重要因素，因?yàn)镽NS會(huì)導(dǎo)致生物分子的化學(xué)修飾并介導(dǎo)損傷，參與多種口腔疾病的病理過程。隨著對(duì)口腔中RNS的作用機(jī)制的研究進(jìn)一步深入，逐漸豐富了人們對(duì)一些口腔疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解，為口腔疾病的預(yù)防和治療提供了新的方向。