萬義彬

（武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072）

1 基因敲入技術(shù)簡介

CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-Associated Proteins）系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中，用于抵抗病毒侵染的免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas系統(tǒng)造成的雙鏈斷裂會引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)機(jī)制以維持細(xì)胞的正常存活。最常見的修復(fù)機(jī)制為同源重組修復(fù)（homology-directed repair，HDR）和非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因敲入策略即通過提供包含插入序列信息的外源DNA模板（donor DNA），利用細(xì)胞內(nèi)的同源修復(fù)機(jī)制在Cas蛋白造成的雙鏈斷裂位置完成特定序列的敲入。本文通過討論基因敲入技術(shù)的關(guān)鍵影響因素，對效率改進(jìn)相關(guān)的研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)闡述。

2 基因敲入效率的影響因素

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因敲入技術(shù)由兩部分組成。第一部分是CRISPR/Cas系統(tǒng)在確定的靶點(diǎn)處進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂缺口。在這一過程中，CRISPR/Cas系統(tǒng)的切割效率會對基因敲入造成巨大影響，切割后留下的雙鏈缺口的類型也極為重要。第二部分是細(xì)胞啟動修復(fù)機(jī)制，以外源donor DNA為同源模板，進(jìn)行同源修復(fù)從而將donor DNA上帶有的特定序列插入到靶點(diǎn)缺口處完成基因敲入過程。donor DNA的設(shè)計(jì)與基因敲入效率息息相關(guān)，此外，DNA修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵基因涉及到細(xì)胞對于同源修復(fù)途徑或者非同源末端連接途徑的選擇和效率控制，對基因敲入的效率也有極大影響。不僅如此，由于同源修復(fù)只發(fā)生在細(xì)胞周期的S期和G2/M期，細(xì)胞周期的調(diào)控也十分關(guān)鍵。

3 提高基因敲入效率的策略

3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)改造以提高基因敲入效率。研究發(fā)現(xiàn)，包含5’突出末端的雙鏈缺口更有利于同源修復(fù)的進(jìn)行[1]。SpCas9的切割造成的雙鏈缺口是平末端結(jié)構(gòu)，因此，將SpCas9突變?yōu)橹痪邆鋯捂溓懈罨钚缘娜笨诿?，通過選取合適靶點(diǎn)從而在基因組上產(chǎn)生包含5‘突出末端的粘性末端缺口，其基因敲入效率明顯提升。

3.2 同源模板優(yōu)化以提高基因敲入效率。作為同源修復(fù)的模板，donor DNA可以以單鏈DNA或雙鏈DNA形式存在。雙鏈DNA模板可以是質(zhì)粒，也可以是雙鏈DNA片段。PCR擴(kuò)增得到的雙鏈模板為平末端，而內(nèi)切酶雙酶切得到的雙鏈模板為粘性末端。研究發(fā)現(xiàn)，后者的效率明顯要高[2]。donor DNA的上下游都含有同源臂，與雙鏈切口的上下游序列同源從而介導(dǎo)精準(zhǔn)高效的同源重組修復(fù)。對于長度為711bp的mCherry基因來說，基因敲入效率隨同源臂的加長先提高后降低，600bp的同源臂會產(chǎn)生最高的基因敲入效率[3]。因此，選取合適長度的同源臂能夠有效提高基因敲入的效率。

3.3 細(xì)胞周期調(diào)控以提高基因敲入效率。細(xì)胞內(nèi)雙鏈斷裂會引發(fā)同源重組修復(fù)（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）。非同源末端連接可在整個細(xì)胞周期中發(fā)生，而同源重組只發(fā)生于S期和G2/M期。使用細(xì)胞周期阻滯藥物，使得細(xì)胞停留在G1/S期或G2/M期，可以顯著提高基因敲入效率。Nocodazole等藥物可以干擾微管聚合，從而使細(xì)胞周期停滯在G2/M期，研究表明，Nocodazole顯著提高了同源重組效率[4]。

3.4 DNA修復(fù)關(guān)鍵基因調(diào)控以提高基因敲入效率。非同源末端連接和同源重組修復(fù)通過兩條不同的通路完成，但兩者是存在相互競爭的。在非同源末端修復(fù)過程中，Ku70/Ku80，DNA-PKcs和DNA Ligase IV極為關(guān)鍵。同源重組修復(fù)過程則主要依賴于CtIP，RPA和Rad51的功能[5]。藥物小分子STL127705，NU7026或SCR7能分別抑制Ku70/Ku80，DNA-PKcs或DNA Ligase IV。小分子 mLN4924，NSC15520或RS-1則能分別對CtIP，RPA或Rad51進(jìn)行激活。通過單個小分子甚至多個小分子藥物對細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)機(jī)制產(chǎn)生的綜合影響，可以將同源修復(fù)效率提高2.3-7.2倍[6]。非同源末端連接（NHEJ）或同源重組修復(fù)（HDR）關(guān)鍵基因也可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控抑制或激活其表達(dá)。這些關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄激活或抑制同樣可以使用CRISPR/Cas系統(tǒng)完成。在靶點(diǎn)位置進(jìn)行切割的同時對DNA修復(fù)的關(guān)鍵基因進(jìn)行抑制或激活，可以成功地將基因敲入效率提高3-5倍[7]。

4 總結(jié)與展望

基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因敲入策略是突變堿基修復(fù)或報(bào)告基因插入的重要方法，對于疾病的治療或者基因定位與功能分析極為關(guān)鍵。通過CRISPR/Cas系統(tǒng)的改造，donor DNA的優(yōu)化，細(xì)胞周期的阻滯以及小分子或轉(zhuǎn)錄調(diào)控等對關(guān)鍵基因的影響，基因敲入的效率能夠得到極大的提高[8]。然而，現(xiàn)有的研究大多數(shù)都只在細(xì)胞層面進(jìn)行，極少數(shù)進(jìn)行了小鼠實(shí)驗(yàn)，距離基因敲入技術(shù)真正應(yīng)用于疾病治療等還有很長的路要走。CRISPR/Cas技術(shù)本身的脫靶性和免疫原性等問題，以及DNA修復(fù)機(jī)制的詳細(xì)細(xì)節(jié)的研究，都將促使高效而精準(zhǔn)的基因敲入技術(shù)的產(chǎn)生與進(jìn)步[9-10]。