張秀義 許浩然 孫亞東

細(xì)胞周期調(diào)控基因突變導(dǎo)致細(xì)胞正常增殖調(diào)節(jié)失控及抗凋亡功能異?？哼M(jìn)是發(fā)生腫瘤的重要原因，細(xì)胞自噬(autophagy)是與細(xì)胞凋亡相似的生物學(xué)過程，是細(xì)胞內(nèi)折疊錯誤、老化的蛋白質(zhì)及受損、失去作用的細(xì)胞器在溶酶體內(nèi)降解的過程[1]?，F(xiàn)代研究顯示自噬作為一種細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的降解通路，對細(xì)胞生存起多種作用。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號通路是重要的自噬信號調(diào)節(jié)通路，磷酸化的mTOR(p-mTOR)是通路活化的生物學(xué)標(biāo)志[2]。自噬相關(guān)基因Beclinl是自噬過程中最重要的正調(diào)節(jié)因子，主要誘導(dǎo)自噬的啟動[3]。自噬相關(guān)蛋白Atg(autophagy related gene)在自噬不同階段發(fā)揮不同的作用，Atg1是誘導(dǎo)自噬通路啟動階段最關(guān)鍵、最直接的蛋白質(zhì)，受mTOR的調(diào)控，誘導(dǎo)自噬的下游信號[4]。既往研究顯示p-mTOR、Beclin1及Atg1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性，在多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。肺癌是目前中國病死率最高的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的絕大多數(shù)，探討三者在NSCLC中表達(dá)及相關(guān)性的研究較少，本研究應(yīng)用免疫組化方法測定p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)水平，分析其表達(dá)與臨床病理特征是否存在相關(guān)性，探討細(xì)胞自噬在NSCLC發(fā)病中的作用機制。

資料與方法

一、一般資料

收集承德市中心醫(yī)院心胸外科于2017年3月到2018年3月行外科手術(shù)治療的NSCLC病例 96例(患者術(shù)前均未進(jìn)行化療、放療及其他抗腫瘤治療，所有病例資料均真實、完整)，其中女性34例，男性62例，年齡48～75歲，平均年齡61.4歲。手術(shù)切除標(biāo)本證實有鱗狀細(xì)胞癌病例50例，腺癌病例46例；低中分化癌病例58例，高分化癌病例38例；無周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例56例，存在周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例40例。NSCLC多發(fā)生于支氣管粘膜上皮及肺泡上皮，本實驗設(shè)正常支氣管和肺泡雙正常對照組，標(biāo)本取自肺癌同側(cè)遠(yuǎn)端距離腫塊3～5 cm的支氣管及肺泡正常組織，其中支氣管粘膜標(biāo)本60例，肺泡標(biāo)本64例。本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，病理切片經(jīng)病理科醫(yī)師診斷證實。

二、檢驗方法

1. 主要試劑： 兔抗人p-mTOR、Beclin1及Atg1單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，免疫組化試劑盒及DAB試劑盒購自丹麥 Dako公司。

2. 常規(guī)組織學(xué)處理： 組織標(biāo)本經(jīng)福爾馬林溶液浸泡、固定，石蠟包埋、切片，HE染色。根據(jù)2004 版WHO肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)判定腫瘤組織學(xué)分類，根據(jù)患者臨床資料確定臨床病理特征。

3. 免疫組織化學(xué)檢測： 采用SP免疫組織化學(xué)法染色，DAB顯色，應(yīng)用已知p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白為陽性的組織切片作陽性對照，采用PBS液代替一抗為陰性對照。

4. 結(jié)果判定： 采用光學(xué)顯微鏡雙盲法觀察染色后切片，p-mTOR、Beclin1及Atg1蛋白均為細(xì)胞質(zhì)染色，每張切片隨機選取5個400倍視野，其中陽性結(jié)果判定以細(xì)胞著色強度及著色細(xì)胞數(shù)占觀察細(xì)胞總數(shù)百分比綜合判定，百分比取平均值：<5%判定為0分，6～25%判定為1分，26～50%判定為2分，≥51%判定為3分。著色強度：不著色判定為0分，淺黃色判定為1分，棕黃色為2分，黃褐色判定為3分。上述兩項得分相加，≤3分判定為陰性結(jié)果，>3分判定為陽性結(jié)果。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、Beclinl蛋白表達(dá)水平組間比較

Beclinl蛋白在NSCLC中表達(dá)陽性率為31.25%(30/96)，如圖1A-D，肺泡及支氣管表達(dá)陽性率分別為75.0%(48/64)、66.67%(40/60)，Beclinl蛋白在NSCLC中表達(dá)水平顯著低于對照組(χ2=29.418、18.723，P<0.01)。Beclinl蛋白在肺鱗癌中陽性表達(dá)率為32.0%(16/50)，顯著低于對照組(χ2=21.079、13.115，P<0.01)。Beclinl蛋白在肺腺癌中表達(dá)陽性率為30.43%(14/46)，顯著低于對照組(χ2=21.612、13.677，P<0.01)。Beclinl蛋白在對照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.044，P=0.307)。

二、p-mTOR蛋白表達(dá)水平組間比較

p-mTOR蛋白在NSCLC中表達(dá)陽性率為66.67%(64/96)，肺泡及支氣管黏膜表達(dá)陽性率分別為10.94%(7/64)、18.33%(11/60)，p-mTOR蛋白在NSCLC表達(dá)水平顯著高于對照組(χ2=48.316、34.554，P<0.01)。p-mTOR蛋白在肺鱗癌中表達(dá)陽性率為72.0%(36/50)，顯著高于對照組(χ2=44.553、32.099，P<0.01)。p-mTOR蛋白在肺腺癌中表達(dá)陽性率為60.87%(28/46)，顯著高于對照組(χ2=30.758、20.258，P<0.01)。p-mTOR蛋白在對照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.365，P=0.243)。

三、Atg1蛋白表達(dá)水平組間比較

Atg1蛋白在NSCLC中表達(dá)陽性率為26.04%(25/96)，如圖2A-D，肺泡及支氣管黏膜表達(dá)陽性率分別為81.25%(52/64)、80.0%(48/60)，Atg1蛋白在NSCLC表達(dá)水平顯著低于對照組(χ2=46.883、43.178，P<0.01)。Atg1蛋白在肺鱗癌中表達(dá)陽性率為26.0%(13/50)，顯著高于對照組(χ2=34.963、32.194，P<0.01)。Atg1蛋白在肺腺癌中表達(dá)陽性率為26.09%(12/46)，顯著高于對照組(χ2=33.473、30.81，P<0.01)。Atg1蛋白在對照組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.031，P=0.86)。

圖1 Beclinl蛋白水平在肺鱗癌、肺腺癌中的表達(dá)；注：A：肺鱗癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×100)；B：肺鱗癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×400)；C：肺腺癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×100)；D：肺腺癌Beclinl蛋白陽性(HE染色 SP×400)

圖2 Atg1蛋白在肺鱗癌、肺腺癌中的表達(dá)；注：A：肺鱗癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×100)；B：肺鱗癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×400)；C：肺腺癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×100)；D：肺腺癌Atg1蛋白陽性(HE染色 SP×400)

四、Beclinl蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析

NSCLC中Beclinl蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，隨著腫瘤體積增大、分化程度下降及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Beclin1蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢，見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌中Beclinl表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

五、p-mTOR蛋白表達(dá)水平、腫瘤分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

隨著腫瘤分化程度下降及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，p-mTOR蛋白表達(dá)水平呈升高趨勢，見表2。

表2 非小細(xì)胞肺癌中p-mTOR表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

六、NSCLC中Atg1蛋白表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性分析

隨著腫瘤體積增大及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，Atg1蛋白表達(dá)水平呈現(xiàn)下降趨勢，見表3。NSCLC組織中Beclin1、Atg1蛋白表達(dá)水平正性相關(guān)，p-mTOR與Beclin1及與Atg1表達(dá)水平均呈負(fù)性相關(guān)。

討 論

細(xì)胞自噬是細(xì)胞器和大分子物質(zhì)降解的細(xì)胞程序性、非凋亡性死亡，通過降解自然衰老及因環(huán)境壓力受損的細(xì)胞器及長壽命、合成或折疊錯誤的蛋白質(zhì)，分解為小分子成分，實現(xiàn)受損細(xì)胞器自我修復(fù)、蛋白質(zhì)循環(huán)利用、加強蛋白質(zhì)檢驗點的檢查糾錯作用，穩(wěn)定基因組、保持細(xì)胞自穩(wěn)狀態(tài)。正常組織中自噬活性長期受到抑制，細(xì)胞自穩(wěn)及糾錯功能無法有效發(fā)揮，有害因素在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)積累，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此保持基礎(chǔ)、適當(dāng)水平的自噬活性對生物體極其重要。在多種人類惡性腫瘤如乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)自噬正性調(diào)節(jié)因子缺失，而在腫瘤細(xì)胞中，大分子物質(zhì)通過自噬降解為小分子物質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長，一旦出現(xiàn)自噬受抑，可觀察到由環(huán)境壓力導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡增多。可見自噬在對腫瘤起雙重作用，在正常組織中是對抗細(xì)胞癌變的防御機制，起抑癌作用，而對已經(jīng)惡變的組織，能使腫瘤細(xì)胞耐受嚴(yán)苛環(huán)境，起促癌作用。

表3 非小細(xì)胞肺癌中Atg1表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

Atg1蛋白是絲氨酸蘇氨酸激酶，是自噬通路啟動階段最關(guān)鍵、最直接的因子，Atg1與 Atg13、Atg17形成復(fù)合體后能夠增強自身酶活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，其活性受mTOR的調(diào)控。mTOR通路是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、自噬的重要信號通路，mTOR作為雷帕霉素的靶分子，具有絲氨酸蘇氨酸激酶活性，是調(diào)控Atg1復(fù)合體活性的最主要上游分子。mTOR信號通路過度活化在多種腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)[5]。p-mTOR表達(dá)水平是mTOR通路活化程度的最敏感指標(biāo)。研究顯示p-mTOR在惡性腫瘤中呈異常高水平表達(dá)，顯示其能抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤生長的特征[6]。mTOR 通過與Atg1結(jié)合形成復(fù)合體，抑制Atg1的激酶活性，進(jìn)一步抑制自噬的發(fā)生。

本文結(jié)果顯示NSCLC組織中p-mTOR的表達(dá)水平顯著升高，而Atg1的表達(dá)水平顯著下降，印證p-mTOR通過與Atg1結(jié)合形成復(fù)合體，抑制Atg1發(fā)揮激酶活性，進(jìn)一步抑制自噬的發(fā)生。由于腫瘤細(xì)胞自噬受到抑制，已經(jīng)出現(xiàn)惡性傾向的細(xì)胞不能被清除掉，細(xì)胞惡性化逐漸積累，最終導(dǎo)致癌變發(fā)生。

Beclin1基因是哺乳動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的唯一的特異性自噬基因，其編碼蛋白與磷酯酰肌醇3激酶家族Ⅲ形成自噬體，調(diào)節(jié)Atg蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中的定位，和它的上下游信號調(diào)節(jié)蛋白組成細(xì)自噬控制通路，在調(diào)節(jié)自噬活性、激活程序性細(xì)胞死亡過程中扮演重要角色，是重要的抑癌蛋白。研究證實Beclin1基因缺失及蛋白表達(dá)減少與腫瘤發(fā)生顯著相關(guān)，小鼠細(xì)胞Beclin1等位基因被敲除后，惡性病變幾率明顯增加，Beclin1+/-突變小鼠較野生型小鼠更容易發(fā)生肺癌、肝癌和淋巴癌[7-8]。人類多種惡性腫瘤存在Beclinl基因失表達(dá)，卵巢癌突變率最高達(dá)75%，乳腺癌突變率也高于50%，乳腺導(dǎo)管癌、胰腺癌及宮頸癌中編碼Beclinl蛋白的mRNA明顯減少，相應(yīng)蛋白表達(dá)水平也顯著降低，乳腺癌細(xì)胞中穩(wěn)定超表達(dá)Beclin1可降低癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力，應(yīng)用基因技術(shù)抑制Beclin1基因表達(dá)可導(dǎo)致舌鱗癌細(xì)胞的自噬水平下降，腫瘤生長加速[9-10]。也有研究發(fā)現(xiàn)Beclin1在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)水平明顯升高，Ahn證實結(jié)直腸癌和胃癌組織中存在Beclin1過表達(dá)，而幾乎沒有或很少在正常胃及結(jié)直腸組織中表達(dá)[11-13]。不同部位腫瘤組織中表達(dá)水平存在明顯差異可能與Beclin1對細(xì)胞自噬過程調(diào)整的雙重性有關(guān)。

本文結(jié)果顯示Beclin1蛋白在NSCLC中表達(dá)顯著下降，提示其直接增強細(xì)胞自噬活性，是最重要的正向調(diào)控基因[14-15]，其基因雜合缺失及蛋白表達(dá)減少是正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的重要原因之一。既往實驗證實前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌中均存在Beclinl單等位基因缺失突變[16-18]，本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)果相一致，Beclinl蛋白在非癌組織中表達(dá)量高于肺癌標(biāo)本，而在癌旁組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明Beclinl在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用，提示自噬活性在NSCLC中明顯降低，驗證了在NSCLC中，自噬體形成減少，自噬發(fā)生強度減弱。由于腫瘤細(xì)胞自噬功能下降、凋亡不足，導(dǎo)致異常細(xì)胞繼續(xù)存貨，異常細(xì)胞持續(xù)增加，最終出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展。

研究證實p-mTOR在低分化胃癌表達(dá)水平明顯高于高分化胃癌[19-20]。朱倫等[21]證實在食管鱗癌中p-mTOR表達(dá)率隨癌組織分化程度升高而降低。本實驗發(fā)現(xiàn)p-mTOR表達(dá)水平與腫瘤分化程度顯著相關(guān)，癌組織分化越好，p-mTOR表達(dá)水平越低，與現(xiàn)有研究結(jié)果相一致，提示p-mTOR正性調(diào)控腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)合成，與肺癌細(xì)胞增殖及惡性傾向密切相關(guān)[22-24]。本實驗證實p-mTOR表達(dá)水平越高，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移幾率越大，腫瘤臨床分期越靠后，預(yù)后越差，對判斷預(yù)后有重要意義。本實驗顯示p-mTOR表達(dá)水平與NSCLC患者年齡、性別、組織學(xué)類型和腫瘤直徑等均無相關(guān)性。

本文結(jié)果顯示Atg1和Beclinl蛋白均在腫瘤體積較小、尚未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Beclinl蛋白在腫瘤組織分化尚可時的表達(dá)水平較高，提示二者在腫瘤早期表達(dá)活躍，仍發(fā)揮一定的促進(jìn)自噬作用，以抑制腫瘤進(jìn)展，其表達(dá)水平隨腫瘤體積增大、分化惡化而下降，考慮持續(xù)基因低表達(dá)及蛋白缺失使腫瘤細(xì)胞自噬功能下降、凋亡不足，導(dǎo)致本應(yīng)該通過凋亡或自噬性死亡的細(xì)胞生長呈現(xiàn)無節(jié)制、不受控狀態(tài)，異常細(xì)胞持續(xù)累積，最終導(dǎo)致癌變。Atg1和Beclinl在出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NSCLC病例中呈現(xiàn)明顯低表達(dá)，考慮肺癌局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與其低水平表達(dá)關(guān)系密切，提示其完全失活多發(fā)生在腫瘤晚期，逐漸喪失其抑癌功能，更具侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，因而預(yù)后較差，在NSCLC的研究結(jié)果一致[25]。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NSCLC中Beclinl和Atg1蛋白表達(dá)正性相關(guān)，推測兩者作為細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)通路的上下游靶點，在肺癌發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同抑癌的作用，其同步低水平表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞自噬能力降低、內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)能力障礙。p-mTOR蛋白表達(dá)分別與Beclinl和Atg1蛋白表達(dá)負(fù)性相關(guān)，p-mTOR在細(xì)胞自噬過程中具有門控作用，其活性是自噬體形成和成熟的關(guān)鍵[26-29]。它在腫瘤細(xì)胞中通常被激活，是細(xì)胞自噬的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，細(xì)胞自噬的許多信號傳導(dǎo)通路都要經(jīng)過mTOR通路，故p-mTOR是細(xì)胞自噬最主要的抑制性因子。腫瘤形成以后， Beclin1、Atg1的高表達(dá)促進(jìn)自噬發(fā)生，mTOR陰性者對自噬的抑制作用減弱，二者所誘導(dǎo)的持續(xù)激活的自噬導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡，從而產(chǎn)生腫瘤抑制作用。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中，mTOR、Beclinl可能通過不同的信號通路各自發(fā)揮其自噬調(diào)控作用。Beclinl基因通過結(jié)合Ⅲ型PI3K，促進(jìn)自噬的發(fā)生，而mTOR受其上游的I型PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，抑制自噬活性，Beclinl過表達(dá)促進(jìn)自噬的發(fā)生，mTOR被激活，抑制自噬活性，并且Beclinl過表達(dá)產(chǎn)生的自噬促進(jìn)作用遠(yuǎn)大于mTOR過表達(dá)產(chǎn)生的自噬抑制作用。

自噬現(xiàn)象因細(xì)胞周圍環(huán)境不同、疾病發(fā)展的不同階段及給予不同的治療干預(yù)措施，會對細(xì)胞會產(chǎn)生不同影響：細(xì)胞自噬可降低DNA突變概率、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤生成；在癌前病變期，自噬受到抑制，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)無法維持，基因組錯誤率增加，致癌突變累積，正常細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化；腫瘤進(jìn)展期對營養(yǎng)物質(zhì)需求增加，通過自噬彌補營養(yǎng)不足，保護(hù)癌細(xì)胞免受化療藥物的作用并延長腫瘤細(xì)胞生存時間，幫助其度過應(yīng)激狀況，使腫瘤細(xì)胞在惡劣環(huán)境中生存和發(fā)展。深入研究p-mTOR、Beclin1及Atg1在肺癌演變過程中的作用機制，為NSCLC早期診斷及預(yù)后評價提供理論基礎(chǔ)，探索通過采用蛋白抑制劑靶向干預(yù)自噬，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬死亡，防止肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，為肺癌的早期預(yù)測及個性化治療提供新思路。