王道猛 錢 斌 孟陽春 何小勇

肺癌是全世界發(fā)病率及死亡率均位于首位的惡性腫瘤[1-2]，肺癌的臨床分型主要分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占80%[3]。在我國非小細(xì)胞肺癌仍是威脅人民健康的頭號殺手，因此肺癌的防治工作仍是一項重要的關(guān)系民生的艱巨任務(wù)，目前非小細(xì)胞肺癌的治療方式主要是以手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療，雖然提高了一部分病人的生存率，但總體生存率仍不容樂觀，因為大多數(shù)肺癌出現(xiàn)癥狀去就診時已處于中晚期，已發(fā)生了癌細(xì)胞的增值及遷徙[4]，因此從基因水平探討肺癌的發(fā)生發(fā)展機制及與臨床預(yù)后的關(guān)系，為肺癌的個體化治療提供科學(xué)的依據(jù)是目前研究的熱點之一。

FOXM1(叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1)編碼的蛋白質(zhì)是參與細(xì)胞增殖的轉(zhuǎn)錄激活因子，編碼的蛋白質(zhì)在M期磷酸化并調(diào)節(jié)幾種細(xì)胞周期基因的表達(dá)，例如細(xì)胞周期蛋白B1和細(xì)胞周期蛋白D1。目前的研究表明FOxMl基因的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[5-8]，如肝癌、食管鱗癌、前列腺癌，肺癌等。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全球最大的腫瘤基因芯片數(shù)據(jù)平臺，在該數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)收集了715個基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，86 733個腫瘤組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)。我們可以選擇自己感興趣的研究基因，在不做實驗的情況下，薈萃分析自己感興趣的基因與預(yù)后的關(guān)系。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫的基因表達(dá)及預(yù)后的挖掘，薈萃分析有利于增加說服力及提供客觀的依據(jù)，本研究薈萃FOXM1和非小細(xì)胞肺癌預(yù)后關(guān)系，為進(jìn)一步研究FOXM1在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生增值遷徙中的作用機制提供線索和依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

在 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中挖掘相關(guān)信息具體過程如下：在此數(shù)據(jù)庫中可根據(jù)自己的感興趣的基因及腫瘤類型設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中首先選擇的篩選條件是：①Cancer Type：lung cancer；②Gene：FOXM1；③Data Type：mRNA 或 DNA；④Analysis type： cancer vs normal analysis；⑤臨界值設(shè)定條件(P值<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)。

二、Kaplan-Meier Plotter分析患者生存情況

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫是一個可以分析目標(biāo)基因與腫瘤預(yù)后相關(guān)性的數(shù)據(jù)庫。我們通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫選擇FOXM1基因分析肺癌的生數(shù)據(jù)，觀察目標(biāo)基因與肺癌的預(yù)后關(guān)系。篩選條件如下：①“Cancer: Lung Cancer”；②“Gene: FOXM1”； ③“Survival: OS”。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

利用t檢驗比較非小細(xì)胞肺癌與正常肺組織中FOXM1基因表達(dá)差異。利用Kaplan-Meier曲線進(jìn)行生存分析FOXM1基因表達(dá)與患者生存的關(guān)系，不同組之間生存率的比較采用Log-Rank檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FOXM1在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中不同腫瘤類型中的表達(dá)差異情況。

在所示的圖中我們可以看到Oncomine 數(shù)據(jù)庫總共收集到455項有關(guān)FOXM1在不同癌癥中的研究分析，其中關(guān)于FOXM1表達(dá)的研究結(jié)果有78項具有統(tǒng)計學(xué)差異。 其中FOXM1高表達(dá)的研究75 項，低表達(dá)降的研究3項。

二、FOXM1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)情況

通過提取Oncomien數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，2001年來共有11項研究12個數(shù)據(jù)集共包括1 178個樣本涉及FOXM1在非小細(xì)胞非癌組織及正常組織之間表達(dá)的比較。組織學(xué)類型包括非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型與正常組織比較。文章分別發(fā)表于Nat Med(2002)、Proc Natl Acad Sci USA(2001)、PLoS One(2010)、PLoS One(2008)、Cancer Res(2012)、Genome Res(2012)、Am J Pathol(2005)、BMC Genomics(2007)、Cancer Res(2005)、Sci Transl Med(2010)和TCGA。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析進(jìn)一步了解到，與正常組織相比，F(xiàn)OXM1基因在全部差異表達(dá)的基因中位數(shù)值排名為392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)。

三、進(jìn)一步分析FOXM1在不同的研究中非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織的表達(dá)差異情況

通過每一個芯片基因研究分析發(fā)現(xiàn)：利用箱式圖比較發(fā)現(xiàn)FOXM1基因在不同的非小細(xì)胞肺癌研究芯片中均呈高表達(dá)，與正常組織相比顯著增高(P<1E-4)。

在這12個數(shù)據(jù)集中，有9項研究顯示FOXM1在非小細(xì)胞肺癌癌組織與正常組織表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，分別是SuLung[9](t=7.030，P=2.05E-9)，Garber Lung[10](t=7.273，P=3.83E-6 )，Beer Lung[11](t=8.092，P=2.07E-7)，Stearman Lung[12](t=6.747，P=1.01E-7 )，Hou Lung[13](t=9.640，P=1.05E-13)，Hou Lung(t=7.301，P=3.23E-7)，Landi Lung[14](t=8.572，P=6.82E-13)，Selamat Lung[15](t=9.550，P=7.25E-14)，Okayama Lung[16](t=7.233，P=4.60E-8)，其余3項研究差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.062，1.376；P>0.05)

四、FOXM1基因表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者生存的關(guān)系

FOXM1表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后關(guān)系究竟如何，我們通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫我們輸入目標(biāo)基因及腫瘤名稱繪制生存曲線分析發(fā)現(xiàn)FOXM1的表達(dá)量的高低與患者的總體生存率(overall survival, OS)有顯著的關(guān)系。高表達(dá)組患者的總體生存率顯著降低(HR=2.02，P<1E-16，圖1A)。表達(dá)越高患者的總體生存率越差，表達(dá)越低患者的預(yù)后越好。分析結(jié)果揭示FOXM1表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)FOXM1表達(dá)量在肺腺癌和肺鱗癌中后預(yù)后仍有顯著的相關(guān)性：在肺腺癌患者中我們發(fā)現(xiàn)FOXM1高表達(dá)水平對總體生存率有顯著影響(HR=2.4，P<1E-16， 圖1B)，在肺鱗癌患者中同樣我們可以發(fā)現(xiàn)相同的結(jié)論，其高表達(dá)水平對總體生存率有顯著的影響(HR=1.33，P=0.018，圖1C)。

討 論

目前肺癌是全世界發(fā)病率及死亡率均位于首位的惡性腫瘤，肺癌的臨床分型主要分為非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌，其中非小細(xì)胞肺癌約占80%。在我國非小細(xì)胞肺癌仍是威脅人民健康的頭號殺手，因此肺癌的防治工作仍是一項重要的關(guān)系民生的艱巨任務(wù)，目前非小細(xì)胞肺癌的治療方式主要是以手術(shù)為主的多學(xué)科綜合治療，雖然提高了一部分患者的生存率，但總體生存率仍不容樂觀，因為大多數(shù)肺癌出現(xiàn)癥狀去就診時已處于中晚期，已發(fā)生了癌細(xì)胞的增值及遷徙，因此急需從基因?qū)用嫣接懛伟┑陌l(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲的機制及與臨床特征。總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的有指導(dǎo)臨床治療及預(yù)后意義的基因，為肺癌的個體化治療提供科學(xué)的依據(jù)是目前研究的熱點。

FOXM1起源于叉頭基因家族，它是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子[17]。FOXM1對于胚胎發(fā)育至關(guān)重要，F(xiàn)OXM1主要在增殖細(xì)胞中表達(dá)或由生長因子釋放誘導(dǎo)。是典型的增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，其刺激細(xì)胞增殖并表現(xiàn)出增殖特異性表達(dá)模式。在DNA合成前期、合成期和有絲分裂期表達(dá)顯著增強，F(xiàn)OXM1通過促進(jìn)進(jìn)入S期和M期來刺激細(xì)胞周期進(jìn)展。而且FOXM1是正確執(zhí)行有絲分裂所必需的。FOXM1靶基因編碼具有執(zhí)行DNA復(fù)制和有絲分裂功能的蛋白質(zhì)。在這種情況下，F(xiàn)OXM1在大多數(shù)腫瘤中充當(dāng)原癌基因并且異常表達(dá)或突變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[18]。目前的研究表明FOXMl基因的過表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[19-21]，如肝癌、食管鱗癌、前列腺癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌等。最近的研究已經(jīng)將FOXM1視為肺癌的新型生物標(biāo)志物之一，因為它不僅刺激細(xì)胞的增殖和生長，而且還與肺腫瘤細(xì)胞的高DNA復(fù)制率有關(guān)，許多研究評估了FOXM1的過表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者生存的預(yù)后因素。但是研究結(jié)果尚無定論，尚未達(dá)成共識。因此我們在Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析FOXM1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)與臨床預(yù)后關(guān)系。

Oncomine數(shù)據(jù)庫是目前全世界最大的基因芯片平臺，可以利用非營利性郵箱注冊，在該數(shù)據(jù)庫中薈萃分析不同腫瘤與目標(biāo)基因的關(guān)系。本文充分利用該數(shù)據(jù)庫的資源，利用研究同一目標(biāo)基因不同研究者的數(shù)據(jù)增加樣本量，在大樣本量的前提下提高該研究結(jié)論的可信度及增加準(zhǔn)確性。本研究首先通過Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘FOXM1基因在頭頸部癌，肝癌，肺癌，乳腺癌等常見腫瘤中的表達(dá)信息，結(jié)果顯示在Oncomine 數(shù)據(jù)庫總共收集到455 項關(guān)于FOXM1不同腫瘤中的研究，其中關(guān)于FOXM1表達(dá)的研究結(jié)果有78項具有統(tǒng)計學(xué)差異。 其中FOXM1高表達(dá)的研究75項，低表達(dá)降的研究3項。研究表明FOXM1在常見腫瘤中處于高表達(dá)狀態(tài)與Carter等[22-23]的研究結(jié)果是一致的。進(jìn)一步利用Oncomine數(shù)據(jù)庫對肺癌相關(guān)研究進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，2001年來共有11項研究12個數(shù)據(jù)集共包括1 178個樣本涉及FOXM1在非小細(xì)胞非癌組織及正常組織之間表達(dá)的比較。組織學(xué)類型包括非小細(xì)胞肺癌的常見病理類型與正常組織的比較。通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中薈萃分析深入挖掘進(jìn)一步了解到，與正常的肺組織相比，F(xiàn)OXM1基因在全部差異表達(dá)的基因中位數(shù)值排名為392.0，P=0.002，研究揭示FOXM1在非小細(xì)胞肺癌中呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)。

圖1 FOXM1表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后關(guān)系；注：A：NSCLC(n=1 926)；B：adenocarcinoma(n=720)；C：squamous cell carcinoma(n=524)

KM Plotter數(shù)據(jù)庫是目前全球比較通用的腫瘤生存相關(guān)的在線分析數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫可以分析18 000多個癌癥樣本評估54 000多個基因?qū)ι媛实挠绊憽Ｆ渲邪?00余例乳腺癌、1 800余例卵巢癌、2 400余例肺癌、360余例肝癌等相關(guān)的生存數(shù)據(jù)。在該數(shù)據(jù)庫中我們可以分析54 000多個基因與2 400余例肺癌的生存狀況，而且可以對肺鱗癌和肺腺癌進(jìn)行亞組分析。本研究發(fā)現(xiàn)在KM plotter 數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù)揭示FOXM1與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后關(guān)系可見FOXM1表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。在研究中可見 FOXM1的表達(dá)量對患者的總體生存率(overall survival, OS)有顯著的影響。低表達(dá)量的非小細(xì)胞肺癌預(yù)后顯著好于高表達(dá)量的非小細(xì)胞肺癌預(yù)后 (HR=2.02，P<1E-16，圖1A)。以上結(jié)果顯示FOXM1表達(dá)量是非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后不良因素之一。我們在該數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步分析FOXM1表達(dá)量與肺腺癌和肺鱗癌的預(yù)后關(guān)系表明：在肺腺癌患者中，F(xiàn)OXM1高表達(dá)量對生存率有明顯的影響(HR=2.4，P<1E-16， 圖1B)，同樣的數(shù)據(jù)提取方法，我們發(fā)現(xiàn)在肺鱗癌患者中，其高表達(dá)量對對生存率有明顯的影響作用 (HR=1.33，P=0.018，圖1C)。但仍需要增加樣本量，通過分子生物學(xué)技術(shù)在蛋白和分子水平上對FOXM1在不同非小細(xì)胞肺癌組織類型中的表達(dá)水平及作用機制進(jìn)行進(jìn)一步分析驗證。發(fā)現(xiàn)FOXM1通過何種通路調(diào)控非小細(xì)胞的增值侵襲作用，F(xiàn)OXM1有可能成為判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個潛在生物標(biāo)志物

綜上所述，我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫對FOXM1在非小細(xì)胞肺癌組織中表達(dá)的相關(guān)信息挖掘，我們拖過研究認(rèn)為FOXM1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)。表達(dá)越高，患者的預(yù)后越差。利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行大樣本分析，可以避免小樣本研究產(chǎn)生的誤差，F(xiàn)OXM1的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后呈正相關(guān)。FOXM1有可能成為判斷非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的一個潛在生物標(biāo)志物。FOXM1在非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制，仍需實驗來進(jìn)一步研究。