李元昆 崔金全 廖予妹 魯笑欽 胡 濱 顧曉荔

(鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450000)

卵巢癌是臨床常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌及宮體癌，病死率居于婦科惡性腫瘤首位[1]。卵巢癌起病隱匿，確診時(shí)多數(shù)患者已進(jìn)展至中、晚期，病情進(jìn)展迅速、預(yù)后生存期短[2]。因此，了解卵巢癌發(fā)病機(jī)制，尋找有效預(yù)測疾病預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物對(duì)疾病診療具有重要意義。研究表明，免疫失衡可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展，但具體調(diào)控機(jī)制尚未明確[3]。CD4+T淋巴細(xì)胞亞群中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)與輔助性T細(xì)胞17(helper T cells 17，Th17)處于平衡狀態(tài)，疾病狀態(tài)下兩者在外周血中數(shù)量、功能均發(fā)生異常，近年來Th17與Treg平衡狀態(tài)與腫瘤的關(guān)系報(bào)道較多，但關(guān)于其在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用報(bào)道較少，需要進(jìn)一步研究探討[4，5]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測各臨床分期卵巢癌患者及健康體檢者外周血中Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率，分析二者在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用，并采用Logistic回歸分析法分析導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素，明確Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率與疾病預(yù)后死亡的相關(guān)性，以期為臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2015年10月～2016年9月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的105例卵巢癌患者設(shè)為卵巢癌組，年齡32～71歲，平均年齡(50.82±6.15)歲；按照國際婦產(chǎn)聯(lián)合會(huì)(International Federa-tion of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)卵巢癌臨床分期分為Ⅰ期17例，Ⅱ期27例，Ⅲ期41例，Ⅳ期20例[6]；組織分型為漿液性囊腺癌79例，黏液性囊腺癌20例，子宮內(nèi)膜樣癌6例；單側(cè)腫瘤41例，雙側(cè)腫瘤64例。所有患者均經(jīng)病理證實(shí)為卵巢癌，排除其他類型惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、合并嚴(yán)重肝腎功能障礙者。所有患者治療均以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔助化療時(shí)間≤6個(gè)療程者63例，>6個(gè)療程者42例；術(shù)后殘存病灶≤1 cm者51例，>1 cm 者54例。另取同期體檢中心45例健康體檢者為健康組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)， 所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)液(武漢普諾賽生命科技有限公司);氟波酯、離子霉素、布雷桿氏菌素A(美國Sigma公司);破膜劑(美國Invitrogen公司);CD4-FITC、Alexa Fluor647 IL-17、PE-Foxp3單克隆抗體(美國Abcam公司);BD LSRFortessa X-20型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集、外周血單個(gè)核細(xì)胞分離及培養(yǎng) 所有患者采集靜脈血前均未進(jìn)行手術(shù)、化療及免疫治療。采集卵巢癌患者及健康受試者空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，2 h內(nèi)處理完畢。取100 μl肝素抗凝血，加入100 μl RPMI1640培養(yǎng)液混勻，加入10 μl濃度為25 μg/L的氟波酯工作液、10 μl濃度為1.0 g/L 的離子霉素工作液、20 μl濃度為1.7 g/L的布雷桿氏菌素A工作液，混勻后于37℃、5%CO2條件下刺激培養(yǎng)3 h備用。

1.2.2Th17、Treg細(xì)胞檢測 取刺激培養(yǎng)3 h的全血細(xì)胞600 μl，2 000 r/min離心2 min，取沉淀細(xì)胞，加入10 μl CD4-FITC單抗，避光孵育15 min，PBS洗滌后加入100 μl固定液，避光孵育15 min，PBS再次洗滌、離心后，取沉淀細(xì)胞，加入100 μl破膜劑，輕柔混勻，避光孵育5 min，加入10 μl Alexa Fluor647 IL-17抗體(或10 μl PE-Foxp3抗體)，混勻后避光孵育15 min，PBS再次洗滌細(xì)胞，離心取沉淀細(xì)胞后，流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17、Treg細(xì)胞百分率。

1.2.3臨床資料統(tǒng)計(jì) 查閱病例及復(fù)診記錄，統(tǒng)計(jì)可能影響患者預(yù)后生存的相關(guān)因素，包括年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤位置、組織分型、組織分化程度、臨床分期、殘存病灶大小(手術(shù)切除后病灶大小)、化療療程、Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率。

1.2.4隨訪 以電話或復(fù)診方式隨訪，隨訪統(tǒng)計(jì)患者3年期間生存情況，以有明確病理學(xué)診斷的確診時(shí)間為起始時(shí)間，以死亡或隨訪截止時(shí)間(3年)為終止。所有患者均完成隨訪，無失訪病例。將3年內(nèi)死亡患者納入死亡組，其余為生存組。

1.2.5Logistic回歸分析法賦值 分別以是否絕經(jīng)(是=0、否=1)、腫瘤位置(單側(cè)=0、雙側(cè)=1)、組織分型(漿液性囊腺癌=0、黏液性囊腺癌=1、子宮內(nèi)膜樣癌=2)、組織分化程度(高分化=0、中分化=1、低分化=2)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0、Ⅲ～Ⅳ期=1)、殘存病灶大小(≤1 cm=0、>1 cm=1)、化療療程(>6=0、≤6=1)及連續(xù)變量年齡、Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率等可能導(dǎo)致患者死亡的因素為自變量，以生存情況(生存=0、死亡=1)為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。

1.2.6觀察指標(biāo) ①健康組與卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率比較；②不同臨床分期卵巢癌患者Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率比較；③Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率及其他可能影響卵巢癌預(yù)后的因素比較；④影響卵巢癌預(yù)后因素的Logistic回歸分析。

2 結(jié)果

2.1健康組與卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率比較 卵巢癌組Th17百分率[(2.94±0.61)%]高于健康組[(1.05±0.24)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.097，P<0.001)；卵巢癌組Treg百分率[(13.65±1.44)%]高于健康組[(5.80±1.01)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=33.206，P<0.001)；卵巢癌組Th17/Treg細(xì)胞百分率[(21.54±2.47)%]高于健康組[(18.10±2.01)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.241，P<0.001)。

2.2不同臨床分期卵巢癌患者Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率及Th17/Treg比較 Ⅲ～Ⅳ期患者Th17百分率為[(3.05±0.70)%]，高于Ⅰ～Ⅱ期患者的[(2.79±0.41)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.204，P=0.030)；Ⅲ～Ⅳ期患者Treg百分率為[(14.14±2.17)%]高于Ⅰ～Ⅱ期患的[(12.97±1.35)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.160，P=0.002)；Ⅲ～Ⅳ期患者Th17/Treg細(xì)胞百分率為[(21.57±2.32)%]，Ⅰ～Ⅱ期患者為[(21.51±2.67)%]，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.123，P=0.903)。

2.3可能影響卵巢癌預(yù)后的因素比較 隨訪3年均無脫落患者，3年存活率為68.57%(72/105)；死亡組和存活組患者年齡、是否絕經(jīng)、腫瘤位置、組織分型及分化程度分布情況比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；死亡組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、殘存病灶>1 cm、化療≤6個(gè)療程患者構(gòu)成比及Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率均高于存活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 可能影響卵巢癌預(yù)后的因素比較Tab.1 Comparison of factors that may affect the prognosis of ovarian cancer

2.4影響卵巢癌預(yù)后因素Logistic回歸分析 經(jīng)Logistic回歸分析，臨床分期、殘存病灶大小、化療療程、Th17、Treg及Th17/Treg細(xì)胞百分率均是導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素(OR=2.670、2.776、2.246、4.145、2.659、3.971，P<0.05，表2)。

表2 影響卵巢癌預(yù)后因素Logistic回歸分析Tab.2 Logistic regression analysis of factors affecting the prognosis of ovarian cancer

3 討論

目前，卵巢癌發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究者認(rèn)為可能涉及女性外源性激素、遺傳、環(huán)境及免疫功能等多種因素。研究表明，多種惡性腫瘤均存在外周血T淋巴細(xì)胞亞群失衡狀態(tài)，新近發(fā)現(xiàn)的Treg、Th17失衡已逐漸成為研究熱點(diǎn)[7,8]。Th17主要以高水平分泌IL-17為特征參與自身免疫及過敏反應(yīng)過程[9]。Treg屬于免疫負(fù)調(diào)控細(xì)胞，在腫瘤免疫耐受中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)，卵巢癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤患者外周血均存在Treg和Th17數(shù)量增多現(xiàn)象[10,11]。因此，研究腫瘤微環(huán)境中Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率變化對(duì)了解疾病狀態(tài)、預(yù)后預(yù)測有重要意義。

本研究中，卵巢癌組Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率均高于健康組，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者Th17、Treg百分率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，Ⅲ～Ⅳ期與Ⅰ～Ⅱ期患者Th17/Treg細(xì)胞百分率無明顯差異，提示外周血Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率變化可能參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展。Zhu等[12]通過檢測126例卵巢癌及26例卵巢良性腫瘤組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌較卵巢良性組織中Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率更高，且晚期上皮性卵巢癌中二者百分率較早期更高，提示Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率與上皮性卵巢癌疾病嚴(yán)重程度有關(guān)，與本研究結(jié)果相符。既往研究表明，Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)增加，可能與癌細(xì)胞及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌大量CC基序趨化因子配體-22，從而招募Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)癌細(xì)胞增過程有關(guān)[13]。此外，Treg所分泌的TGF-β可促進(jìn)Th17分化過程，使腫瘤微環(huán)境長期維持慢性炎癥狀態(tài)，而Th17大量分泌IL-17可促進(jìn)癌細(xì)胞遷移[14-16]。因此，Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率增高可能促進(jìn)卵巢癌發(fā)生發(fā)展，其原因可能為Th17、Treg細(xì)胞失衡導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境免疫失衡，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移等過程，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步發(fā)展。

此外，本研究中死亡組臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、殘存病灶>1 cm、化療≤6個(gè)療程患者構(gòu)成比及Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率均高于存活組；經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期、殘存病灶大小、化療療程、Th17及Treg百分率均是導(dǎo)致卵巢癌預(yù)后死亡的危險(xiǎn)因素，提示影響卵巢癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素較多，除臨床分期、殘存病灶大小及化療療程等常規(guī)危險(xiǎn)因素外，外周血Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率與疾病預(yù)后也密切相關(guān)。Fu等[17]研究發(fā)現(xiàn)外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化與乳腺癌術(shù)后免疫抑制有關(guān)，且與疾病預(yù)后生存期關(guān)系密切。Yang等[18]證實(shí)，Treg、Th17失衡與肺癌患者預(yù)后不良顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。由此可知，Treg、Th17升高及比例失衡可能提示卵巢癌局部微環(huán)境免疫失衡，導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖及遷移風(fēng)險(xiǎn)增加，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的預(yù)后不良。綜上所述，外周血Th17、Treg、Th17/Treg細(xì)胞百分率變化可能參與卵巢癌發(fā)生發(fā)展，且與疾病預(yù)后關(guān)系密切，進(jìn)一步提示臨床中應(yīng)注重調(diào)控Treg和Th17的平衡狀態(tài)，對(duì)改善卵巢癌預(yù)后有重要意義。