王 澤，郗玲玲，齊劍英，梁新月，楊剛剛,3

(1.河南師范大學 a.生命科學學院;b.河南省-科技部共建細胞分化調控國家重點實驗室培育基地，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.上海大學 生命科學學院，上海 200444；3.河南省功能性蛋白應用工程技術研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453007)

0 引言

豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)是當前全球重點研究的100種新藥之一，已有研究表明：作為新型抗腫瘤和抗病毒藥物，ONC特異性降解轉運核糖核酸(transfer ribonucleic acid,tRNA)的作用機制，能夠有效殺傷多種實體腫瘤[1]，其抗病毒活性大于現有98%的抗病毒化合物[2]。ONC可選擇性殺傷腫瘤細胞，且對正常細胞基本無影響[3-4]，具有特異性強、免疫原性低和不易產生耐藥性等優(yōu)點，目前已在歐洲作為“孤兒藥”上市。

維生素C(Vitamin C,VC)是一種水溶性維生素，具有抗氧化、免疫調節(jié)和預防感冒等多種功能。VC具有價格低廉和大劑量使用無毒等優(yōu)點，并被證實在癌癥的預防與治療，以及減輕化療不良反應方面具有明顯的效果，是近年來抗癌藥物研究的熱點[5-8]。

目前，ONC和VC的聯合作用尚未見報道，為增加ONC的腫瘤殺傷效果，減少不良反應，同時充分利用 VC的優(yōu)點和良好的抗腫瘤特性，本文以大鼠肝癌RH-35細胞為研究對象，研究兩種藥物的單獨與聯合作用，評估兩者聯合作用的效果，為后期的腫瘤藥物聯合開發(fā)奠定基礎。

1 試驗

重組ONC由本實驗室純化制備，純度高于95%[9]；VC粉末由河南新鄉(xiāng)華星藥廠提供；大鼠肝癌RH-35細胞來源于中科院上海生命科學研究院細胞庫；伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM)和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于Gibico公司；磺酰羅丹明B(sulforhodamine B，SRB)購于Sigma公司；Hoechst33258染色試劑盒購于碧云天公司；Hoechst凋亡檢測試劑盒PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I購于BD 公司；其余試劑均為國產分析純。

1.1 細胞培養(yǎng)

大鼠肝癌RH-35細胞培養(yǎng)于含10%(體積分數)FBS、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、飽和濕度、含5%(體積分數)CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。傳代后的對數期細胞經質量分數為0.25%的胰酶消化，稀釋至5×104個細胞/mL后接種于96孔板，每孔90 μL(約5×103個細胞)。顯微鏡下觀察鋪板密度均勻后，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件為37 ℃、飽和濕度、5%(體積分數)CO2。

1.2 ONC和VC單藥處理

在96孔板中分別加入10 μL系列稀釋的藥物，對照組加入10 μL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)，單藥物組分為ONC組和VC組。ONC組藥物濃度依次為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、12 μmol/L和16 μmol/L，VC組藥物濃度依次為800 μmol/L、1 200 μmol/L、1 600 μmol/L、2 000 μmol/L和2 400 μmol/L，每個濃度5個復孔。

1.3 ONC和VC聯合用藥

以藥物的半抑制濃度(50% inhibitory concentration，IC50)為基準，配制4種不同體積比(4∶1、3∶2、2∶3、1∶4)的混合藥液。以V(ONC)∶V(VC)= 4∶1為例，取體積分數為80%IC50的ONC與體積分數為20%IC50的VC進行混合，混合后每種溶液用PBS連續(xù)稀釋，設定6個梯度。然后，各取10 μL混合藥液加入96孔板中，對照組加入10 μL PBS，每個濃度5個復孔，24 h后使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。

1.4 SRB法檢測細胞增殖抑制率

藥物處理24 h后，在培養(yǎng)孔中加入25 μL三氯乙酸固定1 h。洗滌細胞后加入50 μL 質量分數為0.4%的SRB溶液染色，使用體積分數為1%的乙酸洗去多余染料并進行干燥。然后，加入150 μL、10 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液振蕩溶解，使用酶標儀在540 nm波長下測定吸光值，計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(對照組吸光值-試驗組吸光值)×100%/對照組吸光值。單藥組直線回歸可計算出藥物IC50值。聯合用藥組每種溶液可得到2個IC50，分別對應ONC和VC。

1.5 聯合指數的計算

聯合指數(combination index,CI)指在聯合治療時，對某一效應測量終點，定量測定藥物相互作用的程度。通過計算CI可初步確定兩種藥物的相互作用。若CI小于1，說明兩藥聯用具有協同效應；若CI大于1，則表示兩藥聯用具有拮抗效應[10]。CI的計算公式為CI=C50A/IC50A+C50B/IC50B，其中，C50A和C50B分別為A和B兩種藥物在聯用中達到50%抑制時的藥物濃度。CI即各藥物聯合用藥達到50%抑制時的藥物濃度與該藥單獨使用時的IC50之比的總和。

1.6 等效線圖解法分析

在CI的計算公式中，C50n/IC50n可用藥物分數抑制濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)表示，其中，n表示藥物A或藥物B。FIC在等效線中的位置可判定藥物間的相互作用。根據FIC的計算公式可以看出：單藥作用時FIC為1。以ONC的FIC值為橫坐標，VC的FIC值為縱坐標，連接兩種藥物單獨作用的坐標，繪制出等效加成線。在藥物聯合作用時，根據兩種藥物的FIC值，可在等效分析圖上確定聯合作用的點。若該點位于等效加成線的下方，則代表兩種藥物聯用時具有協同作用。

1.7 Hoechst33258染色

藥物處理24 h后，加入體積分數為4%的多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌后加入Hoechst33258染色10 min，在Nikon Eclipse 80i型熒光顯微鏡下(激發(fā)波長約350 nm,發(fā)射波長約460 nm)觀察細胞核形態(tài)變化。

1.8 流式細胞法檢測細胞凋亡情況

用胰酶消化對數期細胞，并以2.0×105個細胞/孔的量接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后分為4組給藥，分別為PBS對照組、ONC單藥組(終濃度為8 μmol/L)、VC單藥組(終濃度為1 600 μmol/L)和聯合用藥組(V(ONC)∶V(VC)= 4∶1)。加藥處理24 h后，收集細胞，PBS洗滌2次，用1×結合緩沖液調節(jié)細胞濃度，加入5 μL AnnexinV-PE和7-AAD混合染色液。在室溫避光條件下孵育15 min，加入400 μL 1×結合緩沖液，400目篩網過濾，1 h內檢測細胞凋亡情況。

1.9 統計學分析

使用SPSS 13.0統計學軟件的單因素方差分析法分析數據組間差異，數據結果用均數±標準差表示，P<0.01表示差異顯著，P<0.001表示差異極顯著。

2 結果

2.1 SRB法檢測細胞增殖抑制率

2.1.1 SRB法檢測 ONC和VC對大鼠肝癌RH-35細胞的單獨作用

不同濃度的ONC和VC單藥處理RH-35細胞24 h后，使用SRB法檢測細胞生長抑制率。圖1為不同濃度單藥對RH-35細胞增殖的影響結果。圖1中，**表示與對照相比差異顯著，P<0.01。由圖1可知：隨著ONC和VC單藥濃度的增加，細胞存活的數目逐漸降低(P<0.01)，ONC和VC作用于RH-35細胞的IC50值分別為8 μmol/L和1 600 μmol/L。

(a) ONC對RH-35細胞的增殖抑制率

(b) VC對RH-35細胞的增殖抑制率

圖1 不同濃度單藥對RH-35細胞增殖的影響

2.1.2 SRB法檢測ONC和VC對大鼠肝癌RH-35細胞的聯合作用

表1 ONC與VC聯合作用于RH-35細胞的IC50值

ONC與VC以不同體積比(4∶1、3∶2、2∶3、1∶4)聯合后處理RH-35細胞的結果顯示：對照組細胞貼壁緊密，生長狀態(tài)良好，細胞核完整；聯合用藥組細胞增殖受到抑制，并呈現不同程度的凋亡。表1為SRB法測定ONC與VC聯合作用于RH-35細胞的IC50值。

2.2 CI值計算和等效性分析

根據CI值計算公式和表1中ONC與VC聯合作用的IC50值，計算出ONC與VC聯合作用于RH-35細胞的CI值和FIC值，如表2所示。由表2可知：4種體積比的CI值分別為0.78、0.83、0.85和0.97。CI值越小，協同效應越明顯。作出ONC和VC聯合作用的等效性分析圖(見圖2)并確定出聯合作用的點。由圖2可見：4個聯合作用點均在等效加成線的下方。CI值計算結果和等效性分析結果均表明：ONC與VC能協同抑制RH-35細胞的增殖，且ONC與VC聯合用藥的最佳體積比為4∶1。

表2 ONC與VC聯合作用于RH-35細胞的

圖2 ONC和VC聯合作用的等效性分析圖

2.3 細胞形態(tài)的變化

藥物處理24 h后，倒置顯微鏡觀察RH-35細胞的形態(tài)，結果如圖3所示。由圖3a可以看出：PBS對照組的RH-35細胞形態(tài)正常，輪廓清晰，結構緊密，貼壁牢靠，生長狀態(tài)良好。由圖3b、圖3c和圖3d可以看出：經藥物處理后，單藥組和聯合用藥組(以RH-35細胞形態(tài)變化最明顯的V(ONC)∶V(VC)=4∶1組為例)的細胞密度均明顯降低，且均出現細胞皺縮與變形，細胞內呈晶亮的小圓點，貼壁不緊甚至脫落死亡等現象。

(a) PBS組

(b) ONCIC50組

(c) VCIC50組

(d)V(ONC)∶V(VC)= 4∶1

圖3 藥物處理24 h后RH-35細胞形態(tài)

2.4 Hoechst染色法觀察細胞核的變化

核內脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)斷裂、染色質固縮、細胞核增大是細胞凋亡的顯著特征。用Hoechst染色法觀察藥物處理24 h后RH-35細胞核形態(tài)，結果如圖4所示。由圖4a可以看出：PBS對照組的RH-35細胞核完整，著色均勻。由圖4b、圖4c和圖4d可以看出：藥物處理組RH-35細胞核體積增大，并呈碎塊狀致密濃染，多處可見呈月牙形的典型凋亡現象和發(fā)芽起泡形成的凋亡小體(如圖4b、圖4c和圖4d中箭頭所示)。其中，聯合用藥組(以細胞核形態(tài)變化最明顯的V(ONC)∶V(VC)= 4∶1組為例)出現細胞核體積變大，染色質凝聚、邊緣化，呈月形的典型凋亡現象，說明聯合用藥組促進凋亡的效果優(yōu)于單藥組。

(a) PBS組

(b) ONCIC50組

>(c) VCIC50組

(d)V(ONC)∶V(VC)= 4∶1

圖4 藥物處理24 h后RH-35細胞核形態(tài)

2.5 凋亡檢測

采用Annexin V-PE/7-AAD雙染法結合流式細胞法，檢測ONC和VC對大鼠肝癌RH-35細胞凋亡的影響。研究結果表明：PBS對照組、ONC單藥組、VC單藥組和聯合用藥組(V(ONC)∶V(VC)= 4∶1)的細胞凋亡率分別為(4.24±0.36)%、(61.53±2.98)%、(15.73±3.08)%和(73.65±3.38)%。ONC單藥組和VC單藥組的細胞凋亡率與PBS對照組存在顯著差異(P<0.01)，且聯合用藥組的促進凋亡作用優(yōu)于單藥組，與PBS對照組存在極顯著差異(P<0.001)。

3 討論

一般的腫瘤治療方法(化學藥物治療和放射治療)，在發(fā)揮破壞和殺傷腫瘤細胞作用的同時，對非腫瘤細胞(分裂期的正常細胞)也會產生較大損傷，且長期化療易產生抗藥性，導致治療效果下降。近年來，聯合藥物治療成為癌癥治療的新熱點。采用有協同作用的藥物聯合，有利于降低由單一藥物濃度高引起的藥物毒性和耐藥性，同時可調控異常細胞的多個信號通路，將治療效果最大化，可有效降低治療成本[11-12]。

ONC和VC的作用機制與現有腫瘤治療藥物有明顯區(qū)別。ONC可以直接降解tRNA殺傷腫瘤細胞，除了tRNA外，核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid,rRNA)、信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)和微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)甚至它們的前體都是ONC的作用靶標[13]，而VC通過在腫瘤細胞外產生大量的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)，引起一系列的氧化應激反應，進而造成DNA損傷，導致癌細胞死亡[14]，因此兩者聯用的方案可能更具有臨床應用潛力。本文以大鼠肝癌RH-35細胞為研究對象，采用SRB法和流式細胞法，測定ONC與VC對RH-35細胞的單獨以及聯合處理的凋亡效果，并用聯合指數和等效線圖解法分析評估聯合效果。單獨或聯合用藥均能有效促進RH-35細胞凋亡，且聯合用藥的殺傷效果優(yōu)于單獨用藥。凋亡檢測結果提示ONC和VC具有協同作用，通過兩種藥物的聯合使用，可以顯著提高RH-35細胞的凋亡率。這與文獻[15]得到的ONC與其他腫瘤藥物聯用可有效提高腫瘤細胞的凋亡率的結論相一致。ONC和VC的協同作用機制推測可能與它們均能夠調節(jié)腫瘤細胞產生ROS，進而調控磷脂酰肌醇3-激酶信號通路誘導自噬發(fā)生，最終促進癌細胞凋亡有關[16]。

4 結論

(1)ONC和VC聯合用藥處理大鼠肝癌RH-35細胞，有效增強了藥物對腫瘤細胞的殺傷能力，證實ONC和VC在體外細胞水平上具有協同促進RH-35細胞凋亡的作用。

(2)ONC和VC的協同作用機制有待于進一步研究，并需要在體內進行驗證，為兩者聯合用藥的應用奠定基礎。

(3)ONC和VC作為廣譜抗腫瘤藥物，研究結果對ONC和VC聯合處理其他實體腫瘤細胞也具有指導意義。