唐海霞,陶吉寒,馮立娟,王中堂,尹燕雷

山東省果樹研究所,山東 泰安 271000

土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的世界性問題[1]，鹽度被認(rèn)為是最重要的非生物脅迫之一[2]，全球近20%的耕地和近半數(shù)的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅[3]。鹽堿脅迫影響著果樹產(chǎn)量、蛋白質(zhì)合成、光合作用以及能量代謝。蘋果、桃等大宗水果耐鹽量不超過0.3%[4,5]，而石榴（Punica granatumL.）在0.5%濃度下能正常生長(zhǎng)[6]。堿脅迫與鹽脅迫相伴生，堿脅迫誘導(dǎo)的抑制效應(yīng)總體上高于鹽脅迫[7]。耐鹽/堿基因表達(dá)、無機(jī)離子的選擇吸收、滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)和抗氧化物的合成是石榴耐鹽堿的關(guān)鍵。解析石榴耐鹽堿的生理和分子機(jī)制對(duì)規(guī)范或提升石榴在鹽堿地栽培技術(shù)，通過分子手段改良和選育耐鹽堿石榴新品種，加快石榴在鹽堿地上的規(guī)模化栽培有重大意義。

1 鹽、堿脅迫對(duì)石榴生長(zhǎng)的影響

1.1 石榴的耐鹽堿能力

土壤中較多的鹽堿通過引起離子毒害[8]、滲透脅迫[9]、氧化脅迫[10]和高PH[11]等方式影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。果樹屬于對(duì)鹽敏感的植物，生長(zhǎng)極限鹽度小，平均為1.4 dS·m-1（0.098%）[1,12]。但是，石榴能夠抵抗中度鹽脅迫（≤300 mmol·L-1(1.76%）[13]鹽脅迫，Bhantana and Lazarovitch[14]對(duì)0～8±1.5 dS·m-1鹽脅迫后植株電導(dǎo)率、蒸散量和生長(zhǎng)系數(shù)進(jìn)行研究后將石榴列為中等鹽敏感植物。筆者以1年生‘泰山紅’為試材，進(jìn)行不同濃度NaCl 和混合鹽堿處理，結(jié)果表明，當(dāng)單鹽濃度在200 mmol L-1（1.17%）以下時(shí)，能較好的生長(zhǎng)；當(dāng)鹽堿交互脅迫后，NaCl 濃度在200 mmol L-1、pH 8.72 時(shí)，苗木受害嚴(yán)重；混合鹽堿對(duì)苗木脅迫要高于單鹽[6]。當(dāng)前，關(guān)于鹽堿脅迫研究存在度量單位不統(tǒng)一的情況，鹽水的濃度與測(cè)試土壤實(shí)際鹽濃度有較大誤差。因此，評(píng)價(jià)植物耐鹽堿能力時(shí)以土壤中鹽濃度為標(biāo)準(zhǔn)較為適宜。

1.2 鹽脅迫的影響

鹽脅迫對(duì)石榴的影響分為直接影響和間接影響。高Na＋、Cl-等離子在植株體內(nèi)積累[9]，一是破壞葉片結(jié)構(gòu)，影響光合、呼吸、和蒸騰速率，降低產(chǎn)量[15,16]，二是打破植物體內(nèi)的離子和水勢(shì)平衡，大量的Na＋、Cl-競(jìng)爭(zhēng)取代植物生長(zhǎng)所必需的K+、Ca2+、Mg2+等元素，抑制細(xì)胞內(nèi)多種酶的活性及蛋白質(zhì)的合成等，干擾正常的代謝過程，引發(fā)生理生化紊亂等[17,18]，對(duì)植物產(chǎn)生直接影響。Naeini[19]研究了4 個(gè)鹽度水平下3 個(gè)石榴品種葉片和根系Cl、Na、K 的分配和枝條生長(zhǎng)的影響表明，NaCl濃度的升高，降低了莖高、節(jié)間的長(zhǎng)度和數(shù)量以及葉片表面積。高濃度的鹽脅迫通過引起土壤水勢(shì)下降對(duì)植株造成間接影響。鹽脅迫下，根系吸水困難，造成植株生理干旱，植株為限制水分缺失，會(huì)關(guān)閉氣孔，葉片的光合速率受影響[20]。Khayyat M,et al.[21]對(duì)兩個(gè)石榴品種進(jìn)行不同鹽濃度脅迫發(fā)現(xiàn)，隨鹽濃度升高，Na+、Cl-分別在莖、葉中大量積累，根系相對(duì)含水量和葉片氣孔導(dǎo)度均明顯降低。

1.3 堿脅迫的影響

濱海鹽堿地上，石榴堿脅迫通常與鹽脅迫相伴產(chǎn)生。鹽脅迫主要由中性鹽如NaCl、Na2SO4造成，而堿脅迫主要由堿性鹽，如碳酸氫鹽和碳酸鹽造成[22]。堿脅迫在鹽脅迫的基礎(chǔ)上又增加了高pH 對(duì)樹體的傷害。鹽堿脅迫對(duì)石榴生長(zhǎng)的影響更為復(fù)雜和嚴(yán)重。高pH 脅迫不僅直接影響根系營(yíng)養(yǎng)和水分吸收，同時(shí)也會(huì)對(duì)根系組織結(jié)構(gòu)造成傷害[23]，根系吸水困難，干枯；葉片氣孔關(guān)閉，枯萎，落葉[24]。土壤過堿，還會(huì)導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)的改變，表現(xiàn)為土壤有機(jī)質(zhì)含量低，板結(jié)，通氣、透水性差，肥力降低等，造成土壤和植物的抗逆性減弱，生產(chǎn)能力降低[25]。

2 石榴耐鹽堿生理機(jī)制

2.1 耐鹽性機(jī)制

石榴在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，形成獨(dú)特的生理機(jī)制來應(yīng)對(duì)鹽脅迫。在鹽脅迫條件下，石榴通過降低根對(duì)Na+的吸收以及阻止離子向地上部的運(yùn)輸減少鹽害[26]。隨著土壤中NaCl 含量的增加，石榴根、枝的K+、Na＋含量均有所增加；當(dāng)NaCl 含量為0.4%時(shí)，K+含量最高，隨后開始下降[27]。Na+、K+經(jīng)過石榴根系時(shí)，K+優(yōu)先被吸收，進(jìn)入木質(zhì)部，Na+、K+從根系向枝條運(yùn)輸及從枝條木質(zhì)部向韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，K+優(yōu)先向地上部及枝條韌皮部積累，而Na+分別在根韌皮部及枝條木質(zhì)部大量積累[28]。

植物遭受鹽脅迫后會(huì)引起膜質(zhì)過氧化，產(chǎn)生多種形式的活性氧（ROS）。面對(duì)脅迫植物生成滲透應(yīng)激蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶等，植物體內(nèi)原來積累的大分子物質(zhì)淀粉、蛋白質(zhì)分解成小分子物質(zhì)糖、氨基酸等，一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)相繼生成，如脯氨酸、甜菜堿等積累[29-30]。抗氧化酶和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)協(xié)同來清除活性氧，解除ROS 對(duì)細(xì)胞造成的損害[31]。研究表明，鹽脅迫下甜菜堿處理對(duì)石榴種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)有顯著影響，甜菜堿處理能夠有效提高石榴幼苗葉片抗氧化酶活性，促進(jìn)可溶性糖和脯氨酸積累，減少丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）積累[32]。劉翠玉等[13]對(duì)3 個(gè)石榴品種鹽脅迫后生理生化研究顯示：隨著鹽濃度增大，石榴體內(nèi)脯氨酸、MDA 顯著升高；可溶性蛋白先降低后升高；SOD、CAT 活性先升高后降低，NaCl 濃度300 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最大值。這表明，在一定的NaCl 濃度下，石榴通過滲透應(yīng)激蛋白及有機(jī)質(zhì)的積累增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力，減輕鹽脅迫對(duì)植株的傷害。

2.2 耐堿性機(jī)制

在堿性土壤下，石榴不僅要應(yīng)對(duì)鹽的脅迫，還要應(yīng)對(duì)高pH 對(duì)根組織結(jié)構(gòu)的傷害[33]。關(guān)于石榴在堿脅迫下的生理機(jī)制還未見報(bào)道。在堿脅迫條件下，水稻、棉花等植株莖和葉中的Na+累積明顯高于鹽脅迫。當(dāng)脅迫強(qiáng)度較大時(shí)，大量的Na+便會(huì)在葉片中積累，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，從而影響光合作用[34]。研究表明，植物根系對(duì)周圍高pH 值環(huán)境的應(yīng)答除了離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，另一重要方面是有機(jī)酸的分泌[35]，如蘋果酸等。植物分泌有機(jī)酸不僅可以維持細(xì)胞內(nèi)pH 穩(wěn)定和離子平衡，還在根外pH 調(diào)節(jié)中起重要作用[36]。徐華華[37]在堿脅迫對(duì)虎尾草有機(jī)酸代謝研究中表明：在堿脅迫下，虎尾草有機(jī)酸含量顯著上升，其中檸檬酸、蘋果酸增幅最顯著；蘋果酸合成酶、檸檬酸合成酶和異檸檬裂解酶是有機(jī)酸代謝的關(guān)鍵酶。

3 石榴應(yīng)對(duì)鹽堿脅迫的分子機(jī)制

植物的耐鹽堿性是由多基因控制的數(shù)量性狀，其分子機(jī)制非常復(fù)雜。鹽堿脅迫通常相伴產(chǎn)生，堿對(duì)植物的傷害往往更高于單鹽的脅迫。鹽堿脅迫條件下，植物離子選擇吸收、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、抗氧化保護(hù)酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白作用相關(guān)的基因相繼被發(fā)掘。目前，石榴耐鹽相關(guān)基因的研究才剛起步，因此，本文基于其他作物耐鹽堿分子機(jī)制的研究，以期為石榴耐鹽堿相關(guān)基因的研究提供參考。

3.1 離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因

鹽堿脅迫對(duì)植株產(chǎn)生離子毒害，植株根系通過調(diào)節(jié)離子進(jìn)出來維持細(xì)胞或組織離子穩(wěn)態(tài),其中維持Na+-K+平衡、植物應(yīng)激反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是植物抗鹽堿的最主要因素[22]。Na+、K+離子轉(zhuǎn)運(yùn)主要由離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行控制。研究表明，棉花和小麥中過表達(dá)AtNHX1（液泡鈉離子和氫離子反向運(yùn)輸體）基因?qū)μ岣咧参锬望}性有重要作用[9]。該基因具有隔離液泡中鈉離子的能力，有效防止Na+在細(xì)胞質(zhì)中的積累[38]。水稻體內(nèi)的Na+和K+的吸收由OsHKT1 和AtHKT1 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來完成，在K+虧缺時(shí)，OsHKT1 在水稻根中特異性介導(dǎo)Na+的轉(zhuǎn)運(yùn)，而AtHKT1 對(duì)K+具有高親和性，可轉(zhuǎn)運(yùn)K+和Na+[39,40]。擬南芥AtCPK6 基因?qū)儆趹?yīng)激誘導(dǎo)的鈣依賴蛋白激酶(CDPK)家族，將該基因轉(zhuǎn)擬南芥進(jìn)行過表達(dá)，鹽脅迫后的脯氨酸和丙二醛(MDA)的變化表明，過表達(dá)植株對(duì)鹽/干旱脅迫的耐受性增強(qiáng)[41]。Zhu,JK,et al.[42]通過對(duì)擬南芥突變體進(jìn)行篩選，獲得了28 個(gè)SOS1 突變體、9 個(gè)SOS2 突變體和1個(gè)SOS3突變體，分析表明，SOS 基因具有相同的功能通路，SOS1、SOS2、SOS3 突變體的耐鹽性與其K+含量有關(guān)，而與Na+含量關(guān)系不大。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)pH 發(fā)生變化或高Na+后，在細(xì)胞膜上就會(huì)觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，產(chǎn)生次級(jí)信使分子（Ca2+和質(zhì)子）等。Shi HZ,et al.[43-45]對(duì)擬南芥SOS 突變體基因進(jìn)行分析顯示，當(dāng)細(xì)胞感知到較高濃度的Na+后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+會(huì)大量富積，SOS3 便結(jié)合游離的Ca2+并激活SOS2 蛋白激酶，活化的SOS3，SOS2 激酶復(fù)合體可以激活質(zhì)膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SOS1，SOS2同樣也可以激活液泡膜上的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHX1 和Ca2+/H+（CAX1）轉(zhuǎn)運(yùn)體[46]。

3.2 滲透脅迫相關(guān)基因

參與滲透調(diào)節(jié)的物質(zhì)主要分為無機(jī)離子和體內(nèi)合成的有機(jī)物質(zhì)，如脯氨酸、甜菜堿等。吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是脯氨酸合成的限速酶。張兆元等[47]從NaCl 處理的野生大豆中克隆得到脯氨酸合成酶基因GsP5CS，表明該基因受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，NaCl 濃度200 mmol/L、300 mmol/L時(shí)相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照的5.83 和12.78 倍。該結(jié)果也證明了GsP5CS基因與野生大豆體內(nèi)脯氨酸的合成具有高度相關(guān)性。膽堿單氧化酶CMO 基因和甜菜堿醛脫氫酶基因BADH 是甜菜堿生物合成過程中關(guān)鍵酶，徐冰等[48]對(duì)轉(zhuǎn)CMO-BADH 雙基因、轉(zhuǎn)CMO 基因和非轉(zhuǎn)基因草地早熟禾進(jìn)行不同梯度的NaCl 脅迫，通過細(xì)胞膜透性、酶活性變化，評(píng)價(jià)2 種基因的轉(zhuǎn)化對(duì)植株耐鹽能力的差別，結(jié)果表明雙轉(zhuǎn)基因>單轉(zhuǎn)基因>非轉(zhuǎn)基因。Takahashi M,et al.[49]把能夠合成大麥麥根酸的基因NaatA和NaatB轉(zhuǎn)入到水稻體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)在堿性土壤中的轉(zhuǎn)化株產(chǎn)量比非轉(zhuǎn)化株高4.1 倍。

3.3 抗氧化脅迫基因

在鹽堿脅迫下，植物會(huì)啟動(dòng)酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)來防止活性氧危害。非酶促系統(tǒng)主要包括參與活性氧清除的抗氧化物，如抗壞血酸、谷胱甘肽等。酶促系統(tǒng)指參與保護(hù)反應(yīng)的酶類，如有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH））等[50]。付暢[51]分析了西伯利亞蓼PsMnSOD基因在鹽堿脅迫下的表達(dá)，研究結(jié)果表明，PsMnSOD基因在酵母中的表達(dá)提高了酵母在鹽堿脅迫下的SOD 酶活性，指出該基因在抵御鹽堿脅迫中起到非常重要的作用。APX 是清除鹽堿脅迫產(chǎn)生的H2O2的主要酶類，對(duì)抗壞血酸具有很高的特異親和性[52]，該基因在朝鮮堿茅中得到分離克隆，構(gòu)建酵母表達(dá)載體YES2-PutAPx，導(dǎo)入酵母IVSC1 菌株后在半乳糖的誘導(dǎo)下分析具有抗氧化性[53]。在土豆和擬南芥CDPKs中，OsCDPK12通過誘導(dǎo)ROS 清除基因OsAPX2/OsAPX8的表達(dá)來減少鹽脅迫下H2O2積累對(duì)植株的傷害[54,55]。

4 生物技術(shù)在石榴上的應(yīng)用

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)尤其第三代測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，利用生物技術(shù)進(jìn)行植物耐鹽育種己經(jīng)越來越普遍。石榴是公認(rèn)耐鹽堿性較強(qiáng)的樹種，但對(duì)其耐鹽堿機(jī)理及分子調(diào)控機(jī)制還未明確。雖然石榴耐鹽堿分子機(jī)制研究起步較晚，但隨著石榴全基因組的破譯及抗逆基因的不斷發(fā)現(xiàn)，石榴現(xiàn)代生物育種可以從以下兩個(gè)方面實(shí)現(xiàn)突破：

（1）組織培養(yǎng)與突變體篩選。利用組培快繁的技術(shù)，將石榴組織接種在含鹽培養(yǎng)基上，通過鹽濃度的升高，直到組織達(dá)到95%的死亡水平，后通過幾次無鹽溶液培養(yǎng)，然后返回到有鹽溶液中進(jìn)行檢驗(yàn)[56]。通過此種方式可篩選具有耐鹽基因株系進(jìn)而獲得耐鹽良種；

（2）利用基因工程手段進(jìn)行石榴耐鹽育種工作。通過鹽脅迫，篩選耐鹽基因，通過操縱這些基因的表達(dá)來提高石榴的耐鹽性[57]。從耐重鹽的植株中篩選耐鹽基因，轉(zhuǎn)基因到石榴苗中，亦可獲得耐鹽新品種。此種方法在楊樹中已獲得成功[58]。彭媛媛等[59]以‘紅玉石籽’籽粒為材料，通過RACE技術(shù)克隆了石榴GPX（谷胱甘肽過氧化物酶基因）基因，利用Real-time PCR 檢測(cè)該基因在鹽脅迫下石榴葉片中的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示鹽脅迫下，PgGPX表達(dá)量顯著上升，推測(cè)PgGPX基因在鹽脅迫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。

5 展望

濱海鹽堿地土壤一般是鹽和堿脅迫同時(shí)存在，且石榴耐鹽堿性與高、低溫，干旱等脅迫密切相關(guān)[60]，因此，石榴耐鹽堿生理機(jī)制十分復(fù)雜。目前石榴的耐鹽堿性主要通過植株形態(tài)、生長(zhǎng)狀況及生理生化等指標(biāo)的變化來鑒定。在石榴耐鹽堿評(píng)價(jià)上，鹽、堿脅迫梯度、苗木發(fā)育期、耐鹽指標(biāo)的調(diào)查、評(píng)價(jià)方法等方面對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均具有顯著影響[6]。因此，石榴耐鹽堿評(píng)價(jià)體系亟需建立。

石榴耐鹽堿分子及遺傳多樣性研究需繼續(xù)深入。世界石榴分子生物學(xué)的研究要遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于蘋果、桃等大宗水果的研究，鹽堿脅迫下的石榴分子生物學(xué)研究更是剛剛起步。石榴作為鹽堿地栽植的先鋒樹種，提供了豐富的耐鹽堿基因。加大對(duì)石榴分子生物學(xué)的研究，不僅有助于培育耐鹽堿石榴良種，更為我國(guó)鹽堿地的果樹改良和治理提供理論基礎(chǔ)，具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)。