施河麗，彭五星，左 梅，陳紅華，譚 軍，尹忠春，向必坤

湖北省煙草公司恩施州公司，湖北省恩施市施州大道119號445000

煙草根結(jié)線蟲病在全國各大煙草種植區(qū)均有發(fā)生，其中湖南、湖北、云南、貴州、四川、山東等地發(fā)生危害較為嚴(yán)重，已成為制約煙草生產(chǎn)的主要病害之一。該病害由根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）侵入煙草植株根部引起，煙草感病后，初期植株整體矮化，生長緩慢，葉片狹窄，葉尖、葉緣褪綠變黃，后期葉片干枯反卷，煙株根系形成大量根結(jié)，似“雞爪狀”，調(diào)制后的煙葉葉片薄，品質(zhì)下降［1-2］。根結(jié)線蟲除了對煙草造成直接危害外，還與許多土傳根莖類病害如煙草青枯病、黑脛病、鐮刀菌根腐病、根黑腐病等引起復(fù)合侵染［3-4］。引起煙草根結(jié)線蟲病的病原線蟲主要有南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita）、花生根結(jié)線蟲（Meloidogyne arenaria）、爪哇根結(jié)線蟲（Meloidogyne javanica）和北方根結(jié)線蟲（Meloidogyne hapla），其中南方根結(jié)線蟲為湖北恩施煙區(qū)的主要病原線蟲。前人的研究表明，在一定范圍內(nèi)，土壤中線蟲活動與土壤砂含量呈線性正相關(guān)［5］，線蟲繁殖率最高的是砂壤土，其次是壤土、粉黏土和黏土［6］。線蟲的發(fā)育和移動在很大程度上與水分有關(guān)，一定的土壤含水率有利于線蟲卵的孵化和二齡幼蟲活動，土壤水分過飽和或過于干燥時對線蟲發(fā)育不利。土壤的養(yǎng)分條件對線蟲生長發(fā)育影響也很大，如土壤鉀含量高可促進(jìn)線蟲發(fā)育，缺鉀則抑制線蟲生長［7］；施用硝態(tài)氮（NO-3）肥有利于根結(jié)線蟲侵染番茄根系，施用銨態(tài)氮肥（NH+4）則增加根結(jié)線蟲雄蟲比例［8］。土壤pH對線蟲分布和活動也有不同程度的影響［9-10］，過酸或偏堿都不利于線蟲的存活。白春明等［11］研究表明，南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲在pH（4.1～11.0）范圍內(nèi)可正常存活。湖北恩施煙區(qū)由于長期連作、化學(xué)肥料施用量大等因素，導(dǎo)致土壤酸化、養(yǎng)分供應(yīng)失衡、物理性狀變差、微生態(tài)環(huán)境惡化，引起煙草根結(jié)線蟲病發(fā)生嚴(yán)重。根結(jié)線蟲病是一種典型的土傳性病害，一旦土壤攜帶線蟲則很難徹底清除?？梢?，控制土壤中的線蟲侵染源數(shù)量是防治該病害的關(guān)鍵。因此通過田間土壤取樣，分析了湖北恩施煙區(qū)長期連作煙田影響南方根結(jié)線蟲密度的土壤理化特性指標(biāo)，旨在明確線蟲密度與土壤理化指標(biāo)的關(guān)系，為通過改善根際土壤生態(tài)環(huán)境、修復(fù)土壤進(jìn)而防治煙草根結(jié)線蟲病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2018年在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩縣的煙葉主產(chǎn)區(qū)曉關(guān)鄉(xiāng)和椒園鎮(zhèn)采集土樣，涉及2個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，共取樣品23個。采樣煙田為連續(xù)植煙15年的田塊，煙田根結(jié)線蟲發(fā)病率50%～70%。在煙葉采收結(jié)束后，用五點(diǎn)取樣法采集深度為15～20 cm根區(qū)土壤，帶回實(shí)驗(yàn)室立即進(jìn)行南方根結(jié)線蟲密度分析，同時進(jìn)行土壤理化特性指標(biāo)的測定。曉關(guān)鄉(xiāng)和椒園鎮(zhèn)兩地相連，氣候條件基本一致。屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤型山地氣候，植煙區(qū)海拔800～1 100 m，濕潤多雨，年均氣溫13.7℃，無霜期263 d，年降水量1 635.3 mm，年日照時數(shù)1 212.4 h。兩地?zé)煵莘N植模式相同，土壤類型為恩施煙區(qū)具有代表性的山地黃棕壤，質(zhì)地為壤土。因此基本消除了氣候條件、栽培制度、土壤類型、土壤質(zhì)地等因素造成的差異。

1.2 南方根結(jié)線蟲密度的測定

提取土壤樣品DNA，利用設(shè)計的南方根結(jié)線蟲特異性引物和標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析［12-14］，根據(jù)循環(huán)閾值（Ct值）計算土壤中南方根結(jié)線蟲密度。由中國科學(xué)院微生物研究所測定南方根結(jié)線蟲密度。

1.3 土壤理化特性指標(biāo)測定

土壤樣品測定指標(biāo)：有機(jī)質(zhì)、土壤團(tuán)聚體平均質(zhì)量直徑（MWD）、含水率、容重、總孔隙度、毛管持水量、毛管孔隙度、通氣孔隙度、pH、堿解氮、有效磷、速效鉀、交換性鉀、交換性鈣、交換性鎂、交換性鈉、有效鐵、有效錳、有效銅、有效鋅、有效硼、陽離子交換量（CEC）等。測定方法：采用重鉻酸鉀容量法測定有機(jī)質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）［15］；采用濕篩法測定MWD［15］；采用烘干法測定含水率［15］；采用環(huán)刀法測定土壤容重［15］；采用環(huán)刀浸泡法測定毛管持水量和毛管孔隙度，用經(jīng)驗(yàn)公式Tp（%）=93.947-32.995Bd（Tp為總孔隙度，Bd為容重）計算總孔隙度，通氣孔隙度為總孔隙度與毛管孔隙度之差［16］；采用電位法測定土壤pH［15］；采用擴(kuò)散法測定堿解氮含量［17］；采用碳酸氫鈉法測定有效磷含量［17］；采用醋酸銨浸提-火焰光度計（PFPT47，英國Jencons公司）法測定速效鉀、交換性鉀和交換性鈉含量［17］；采用醋酸銨浸提-原子吸收光譜儀（900T，美國PE公司）法測定交換性鈣和交換性鎂含量［17］；采用DTPA浸提-原子吸收分光譜儀（900T，美國PE公司）法測定有效態(tài)微量元素鐵、錳、銅、鋅含量［18］；采用水浴浸提-姜黃素比色法測定有效硼含量［15］；采用EDTA-乙酸銨鹽交換法測定陽離子交換量（CEC）含量［15］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；用IBM Statistics SPSS 22.0進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析、逐步回歸分析、相關(guān)分析和通徑分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的描述性統(tǒng)計分析

對土壤理化特性指標(biāo)Х1（有機(jī)質(zhì)）、Х2（MWD）、Х3（含水率）、Х4（容重）、Х5（總孔隙度）、Х6（毛管持水量）、Х7（毛管孔隙度）、Х8（通氣孔隙度）、Х9（pH）、Х10（堿解氮）、Х11（有效磷）、Х12（速效鉀）、Х13（交換性鉀）、Х14（交換性鈣）、Х15（交換性鎂）、Х16（交換性鈉）、Х17（有效鐵）、Х18（有效錳）、Х19（有效銅）、Х20（有效鋅）、Х21（有效硼）、Х22（CEC）以及Y（南方根結(jié)線蟲密度）進(jìn)行描述性統(tǒng)計分析，結(jié)果見表1。從表1可以看出，土壤理化特性各組分的特征參數(shù)存在一定差異。交換性鎂、有效鋅的變幅較大，變異程度也較大，這與其在各個取樣點(diǎn)土壤含量的差異較大有關(guān)；土壤pH變幅為4.27～6.27，均值為5.13，說明各取樣點(diǎn)土壤呈酸性，而酸性土壤適宜南方根結(jié)線蟲的生存、繁殖。南方根結(jié)線蟲密度的變幅和變異系數(shù)均較大（最大值與最小之比為42.20，變異系數(shù)為67.91%），說明各取樣點(diǎn)的南方根結(jié)線蟲密度差異較大。

表1土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的描述性統(tǒng)計分析Tab.1 Descriptive statistics of soil physical and chemical characteristics and density of Meloidogyne incognita

2.2 土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的逐步回歸分析

測驗(yàn)中n=23，為小樣本項(xiàng)目，因此選擇Shapiro-Wilk測試結(jié)果對因變量Y（南方根結(jié)線蟲密度）進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。由表2可知，Y（南方根結(jié)線蟲密度）統(tǒng)計量為0.941，顯著水平P為0.193且大于0.05，因變量Y（南方根結(jié)線蟲密度）的分布接近正態(tài)分布，可以對植煙土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的關(guān)系進(jìn)行逐步回歸分析，找出與南方根結(jié)線蟲密度密切相關(guān)的土壤理化特性指標(biāo)。

由表3可得回歸方程：

相關(guān)系數(shù)R=0.847，決定系數(shù)R2=0.717。

由回歸方程共篩選出了3個對Y（南方根結(jié)線蟲密度）有顯著效應(yīng)的自變量，分別為Х13（交換性鉀）、Х15（交換性鎂）和Х11（有效磷），這3個自變量可以解釋71.7%的因變量變異，其中Х13（交換性鉀）對Y（南方根結(jié)線蟲密度）的作用為正效應(yīng)，Х15（交換性鎂）和Х11（有效磷）對Y（南方根結(jié)線蟲密度）的作用為負(fù)效應(yīng)。說明土壤交換性鉀含量越高，南方根結(jié)線蟲密度越大；土壤交換性鎂和有效磷含量越低，南方根結(jié)線蟲密度越大。

表2南方根結(jié)線蟲密度的正態(tài)性檢驗(yàn)①Tab.2 Normality test on density of Meloidogyne incognita

表3南方根結(jié)線蟲密度與土壤理化特性回歸模型參數(shù)Tab.3 Regression model coefficients between density of Meloidogyne incognita and soil physical and chemical characteristics

2.3 土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的相關(guān)分析

對篩選出的3個土壤理化特性指標(biāo)與南方根結(jié)線蟲密度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。Y（南方根結(jié)線蟲密度）與Х13（交換性鉀）呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r=0.488，說明土壤交換性鉀含量越高，南方根結(jié)線蟲密度越大。Х13（交換性鉀）與Х15（交換性鎂）呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)r=0.437，這表明在一定程度上，土壤交換性鉀含量與土壤交換性鎂含量關(guān)系緊密。

表4土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的相關(guān)分析①Tab.4 Correlation analysis between soil physical and chemical characteristics and density of Meloidogyne incognita

2.4 土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的通徑分析

在逐步回歸分析和相關(guān)分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行通徑分析，Y（南方根結(jié)線蟲密度）與Х11（有效磷）、Х13（交換性鉀）和Х15（交換性鎂）的通徑分析結(jié)果見表5，由此合成土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的通徑分析圖，見圖1。由表5可見，按照直接通徑系數(shù)的大小排序依次為：Х13（交換性鉀）＞Х15（交換性鎂）＞Х11（有效磷），且Х13（交換性鉀）對南方根結(jié)線蟲密度的作用為正效應(yīng)，Х11（有效磷）和Х15（交換性鎂）對南方根結(jié)線蟲密度的作用為負(fù)效應(yīng)。說明土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的直接作用最大（直接通徑系數(shù)為0.803），即土壤交換性鉀含量每提高1個標(biāo)準(zhǔn)單位，南方根結(jié)線蟲密度就增加0.803個標(biāo)準(zhǔn)單位；土壤交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的直接作用次之（直接通徑系數(shù)為-0.655），即土壤交換性鎂含量每提高1個標(biāo)準(zhǔn)單位，南方根結(jié)線蟲密度可降低0.655個標(biāo)準(zhǔn)單位；土壤有效磷含量對南方根結(jié)線蟲密度的直接作用最小（直接通徑系數(shù)為-0.328），即土壤有效磷含量每提高1個標(biāo)準(zhǔn)單位，南方根結(jié)線蟲密度可降低0.328個標(biāo)準(zhǔn)單位。

表5土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的通徑分析Tab.5 Path analysis of soil physical and chemical characteristics and density of Meloidogyne incognita

由于土壤理化特性之間的相互影響、相互作用，土壤理化特性指標(biāo)對南方根結(jié)線蟲密度還有不同程度的間接影響。3個土壤理化特性指標(biāo)與南方根結(jié)線蟲密度的間接通徑系數(shù)之和排序?yàn)椋骇?5（交換性鎂）＞Х13（交換性鉀）＞Х11（有效磷），說明土壤交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的間接影響最大（間接通徑系數(shù)之和為0.319），這與土壤交換性鎂含量和交換性鉀含量的相關(guān)系數(shù)較大有關(guān)，交換性鎂在很大程度上通過交換性鉀路徑間接影響南方根結(jié)線蟲密度。3個土壤理化特性指標(biāo)的直接通徑系數(shù)均大于各自的間接通徑系數(shù)之和，說明土壤有效磷、交換性鉀和交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響主要體現(xiàn)為直接作用。

圖1土壤理化特性與南方根結(jié)線蟲密度的通徑分析Fig.1 Path analysis map between soil physical and chemical characteristics and density of Meloidogyne incognita

3個土壤理化特性指標(biāo)對南方根結(jié)線蟲密度的綜合效應(yīng)依次為：Х13（交換性鉀）＞Х15（交換性鎂）＞Х11（有效磷），說明土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響最大。

3 討論

本研究中湖北恩施煙區(qū)長期連作煙田南方根結(jié)線蟲密度與土壤養(yǎng)分狀況密切相關(guān)，特別是土壤有效磷、交換性鉀和交換性鎂含量指標(biāo)。土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響為正效應(yīng)，說明土壤鉀含量越高，根結(jié)線蟲密度越大，這與Balaji A等［19］、焦加國等［20］、王詩雯［21］的研究結(jié)果一致。其原因可能與恩施煙區(qū)植煙土壤鉀利用率下降導(dǎo)致大量殘留［22］，直接影響到土壤供肥平衡體系有關(guān)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中合理施鉀、穩(wěn)定鉀肥用量對防控?zé)煵莞Y(jié)線蟲病具有重要意義。本研究中還發(fā)現(xiàn)，土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的直接作用和綜合效應(yīng)均最大，說明在篩選出來的3個土壤特性指標(biāo)中，土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響最大，而土壤鉀、植物和根結(jié)線蟲的互作關(guān)系及其相互作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究中土壤有效磷和交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響為負(fù)效應(yīng)，說明南方根結(jié)線蟲密度因土壤有效磷和交換性鎂含量的增加而降低。因此，在煙葉生產(chǎn)中適量增施磷肥能降低南方根結(jié)線蟲密度，這與郭衍銀等［23］的研究結(jié)果一致。土壤鎂含量的增加不利于南方根結(jié)線蟲的生長和繁殖，可能與施用適量鎂可增加植株莖葉中含碳化合物含量，降低可溶性氮含量，在一定程度上提高抗病性有關(guān)［24］，因此適量補(bǔ)充鎂肥也有利于對煙草根結(jié)線蟲病的控制。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，土壤理化特性指標(biāo)間存在相互影響和交互作用。土壤交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的間接影響最大，這與土壤交換性鎂含量和土壤交換性鉀含量顯著正相關(guān)有關(guān)，說明交換性鎂在很大程度上通過交換性鉀而間接影響南方根結(jié)線蟲密度。鉀和鎂作為植物生長發(fā)育的必須元素，在植物—土壤系統(tǒng)中鉀和鎂間既存在協(xié)同作用又存在拮抗作用，鉀、鎂二者間的交互作用對植物生長發(fā)育、養(yǎng)分吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)、生理生化以及土壤中K+、Mg2+都有影響［25］。因此，鉀、鎂二者間的交互作用對南方根結(jié)線蟲密度的影響機(jī)理和生理作用還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

基于湖北恩施煙區(qū)長期連作煙田中影響南方根結(jié)線蟲密度的土壤理化特性指標(biāo)分析結(jié)果表明，土壤有效磷、交換性鉀和交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度有顯著影響，綜合效應(yīng)排序依次為交換性鉀＞交換性鎂＞有效磷，且土壤交換性鉀含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響為正效應(yīng)，土壤有效磷和交換性鎂含量對南方根結(jié)線蟲密度的影響為負(fù)效應(yīng)。因此，對于湖北恩施煙區(qū)長期連作煙田中南方根結(jié)線蟲的防控，建議實(shí)施穩(wěn)鉀、增磷、補(bǔ)鎂的技術(shù)措施。