代發(fā)文 黃玉嵐 于海娜 姚宏明 許甲平 馮一凡

（1.樂山師范學(xué)院，四川樂山614000；2.北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，北京100085；3.常寧德邦生物科技有限公司，湖南衡陽420500）

稀土具有廣譜抑菌作用[1]，用于飼料添加劑具有 促生長、改善飼料報(bào)酬等作用[2]。小鼠應(yīng)用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)稀土元素的來源和劑量影響其對采食量和料肉比的調(diào)控作用[3]。肉雞應(yīng)用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加低劑量稀土有改善生產(chǎn)性能的作用但對胴體性能和健康度無明顯影響[4]。在兩個(gè)斷奶仔豬應(yīng)用檸檬酸稀土的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，稀土對料肉比的改善趨勢作用不可復(fù)制重現(xiàn)，對糞便微生物菌群結(jié)構(gòu)無明顯影響[5]。育肥豬應(yīng)用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用稀土可顯著改善平均日增重和料肉比，但對血清葡萄糖、蛋白質(zhì)、膽固醇等無顯著影響[6]。上述研究報(bào)道表明稀土對動(dòng)物生產(chǎn)性能的調(diào)控并不完全一致，可能與其形式和劑量有關(guān)，也有可能與動(dòng)物生理階段有關(guān)。目前有關(guān)稀土作用機(jī)制的研究主要集中在抑菌效率[1，7-9]和細(xì)胞生長調(diào)控[10-12]方面。這種調(diào)控效果主要受稀土形式和劑量因素影響，研究發(fā)現(xiàn)5種不同稀土元素的水溶性殼聚糖配合物表現(xiàn)出選擇性抑菌性能[1]，適宜劑量稀土鈰（Ce）顯著促進(jìn)水母細(xì)胞細(xì)胞生長[11]。稀土促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖表現(xiàn)出濃度依賴的兩面性，低濃度促生長高濃度抑制生長[12]。

高濃度稀土對菌體生長的抑制作用與其對細(xì)胞DNA 氧化損傷作用有關(guān)[13]，大鼠細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高濃度稀土元素鑭（La）抑制線粒體琥珀酸脫氫酶活性表現(xiàn)出細(xì)胞毒性[14]。植物甾醇是一種甾類化合物，有提高機(jī)體抗氧化能力作用[15]。植物甾醇抗氧化活性的發(fā)揮也存在劑量-效應(yīng)關(guān)系，可防止肝細(xì)胞DNA氧化損傷[16]。上述研究報(bào)道表明，為更好地發(fā)揮有機(jī)稀土改善生產(chǎn)性能的效果，需要注意稀土元素種類、有機(jī)配合物形式、劑量對抑菌活性和細(xì)胞增殖的影響，同時(shí)其與植物甾醇復(fù)合使用可能有助緩解其對細(xì)胞氧化損失作用而進(jìn)一步改善生產(chǎn)性能。本試驗(yàn)旨在以體外抑菌試驗(yàn)和豬腸上皮細(xì)胞增殖試驗(yàn)評(píng)估一種有機(jī)稀土及其與植物甾醇復(fù)合物的應(yīng)用效果，為探討有機(jī)稀土的科學(xué)應(yīng)用方案提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

有機(jī)稀土(REE)：主要成分為稀土（La、Ce）殼糖胺螯合鹽(SQA)、麥飯石，SQA≥12 000 mg/kg，由常寧德邦生物科技有限公司提供。

有機(jī)稀土與植物甾醇復(fù)合物(REP)：主要成分為SQA≥180 000 mg/kg，植物甾醇≥50 000 mg/kg，由常寧德邦生物科技有限公司提供。

豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1 株：北京大偉嘉產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院保存提供。

1.2 有機(jī)稀土抑菌試驗(yàn)

參照QBT 2738—2012 懸液定量法，以生理鹽水將指示菌(典型大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌)濃度稀釋約1×105CFU/ml。分別將3 個(gè)批次REE 和REP 樣品以無菌水分別稀釋至1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml三個(gè)濃度梯度，1個(gè)批次為1個(gè)重復(fù)，每個(gè)濃度梯度處理組3個(gè)重復(fù)。吸取稀釋液10 ml放入滅菌試管中，30 ℃水浴5 min，水浴后將稀釋好的指示菌取200 μl 加入試管中，迅速混勻，并立即計(jì)時(shí)30 min。以生理鹽水代替試驗(yàn)樣品，同時(shí)按照上述步驟操作，作為對照組。采用LB 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)組與對照組存活菌數(shù)，抑菌效率(%)=(對照組菌數(shù)-試驗(yàn)組菌數(shù))/對照組菌數(shù)×100。

1.3 有機(jī)稀土作用腸上皮細(xì)胞增殖

1.3.1 有機(jī)稀土溶解

將REE和REP分別溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，溶解后過濾除菌。使用前用改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)稀釋，使REE 和REP 終濃度為1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml，且DMSO 終濃度不超過1.5%，以含相同DMSO濃度的DMEM培養(yǎng)基液為對照組。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇傳代2～3次后用于試驗(yàn)，將豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗DMEM培養(yǎng)基中，每隔1 d傳代1次，細(xì)胞80%融合度時(shí)按照1:3 傳代比例進(jìn)行傳代，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 有機(jī)稀土作用IPEC-1細(xì)胞MTT增殖試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)報(bào)道豬腸上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)調(diào)控方法[12]，取對數(shù)生長期IPEC-1 采用胰酶消化，以DMEM 培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105個(gè)/ml。將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μl，培養(yǎng)24 h至細(xì)胞單層鋪滿孔底。吸出培養(yǎng)基，加入100 μl 1.3.1 已稀釋好的對照組和不同濃度梯度有機(jī)稀土DMEM 培養(yǎng)基，每組6 個(gè)重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察。移去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌2 次，每孔加入100 μl MTT染色液(2%)，繼續(xù)孵育4 h。移去上清，每孔加入100 μl 異丙醇，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶免檢測儀在595 nm測定吸光度值，細(xì)胞活率計(jì)算公式如下：

1.3.4 REP作用IPEC-1細(xì)胞MTT增殖試驗(yàn)

參照1.3.3 方法以稀釋后的REP 代替REE 開展IPEC-1細(xì)胞MTT增殖試驗(yàn)，測定IPEC-1細(xì)胞595 nm吸光度值和細(xì)胞活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行初步處理，用SPSS 17統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用T檢驗(yàn)法比較REE和REP抑菌效率差異，采用LSD單因素多重比較分析不同濃度REE 和REP 的抑菌效率及其對IPEC-1 細(xì)胞增殖的影響，P<0.05 表示組間差異達(dá)到顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)稀土的抑菌活性

本試驗(yàn)采用懸液定量法評(píng)估了不同濃度有機(jī)稀土(REE)和有機(jī)稀土與植物甾醇復(fù)合物(REP)的體外抑菌效率，結(jié)果見表1、表2、圖1、圖2和圖3所示。由表1、表2和圖1可知，REE 和REP 對大腸桿菌抑菌效率隨濃度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而顯著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP組對大腸桿菌抑菌效率顯著低于同濃度REE 組(P<0.05)。由表1、表2 和圖2 可知，REE和REP對沙門氏菌抑菌效率隨濃度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而顯著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP 組對沙門氏菌抑菌效率為0，顯著低于同濃度REE組(P<0.05)。由表1、表2和圖3可知，與對沙門氏菌抑菌效率規(guī)律相似的是，REE和REP對金黃色葡萄球菌抑菌效率隨濃度(1 mg/ml、100 μg/ml、10 μg/ml)降低而顯著降低(P<0.05)，10 μg/ml REP 組對金黃色葡萄球菌抑菌效率為0，顯著低于同濃度REE 組(P<0.05)。從平均抑菌效率來看，高濃度時(shí)REE 和REP抑菌效率相近，低濃度時(shí)REP組低于REE組。

表1 不同濃度有機(jī)稀土(REE)的抑菌效率(%)

表2 不同濃度有機(jī)稀土與植物甾醇復(fù)合物(REP)的抑菌效率(%)

圖1 不同濃度REE和REP對大腸桿菌體外抑菌效率的影響

2.2 不同濃度REE和REP對IPEC-1增殖的影響

為探討有機(jī)稀土及其與植物甾醇復(fù)合物對豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1 增殖的影響，本試驗(yàn)采用MTT 法應(yīng)用不同濃度REE 和REP 處理IPEC-1 細(xì)胞24 h后測定細(xì)胞活率，結(jié)果見圖4 和圖5。由圖4 可知，1 mg/ml、500 μg/ml REP 組IPEC-1 細(xì)胞活率均顯著低于對照組(P<0.05)，同時(shí)也顯著低于100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml REP組(P<0.05)。50 μg/ml REP組IPEC-1 細(xì)胞活率顯著高于對照組(P<0.05)，比對照組提高21.95%(P<0.05)，而100 μg/ml、10 μg/ml REP組與對照組之間均無顯著性差異(P>0.05)，50 μg/ml是本試驗(yàn)條件下REP 促進(jìn)IPEC-1 細(xì)胞增殖的最佳劑量。由圖5 可知，1 mg/ml、500 μg/ml、100 μg/ml REE 組IPEC-1 細(xì)胞活率均顯著低于對照組(P<0.05)，同時(shí)也顯著低于50 μg/ml、10 μg/ml REE 組(P<0.05)，而50 μg/ml、10 μg/ml REE 組與對照組之間均無顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，高濃度REE 和REP 均顯著抑制IPEC-1 細(xì)胞增殖，適宜濃度(50 μg/ml)REP 顯著促進(jìn)IPEC-1 細(xì)胞增殖，本試驗(yàn)濃度條件下未見顯著促進(jìn)IPEC-1 細(xì)胞增殖的REE 處理組。

圖2 不同濃度REE和REP對沙門氏菌體外抑菌效率的影響

圖3 不同濃度REE和REP對金黃色葡萄球菌體外抑菌效率的影響

圖4 不同濃度REP對IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響

圖5 不同濃度REE對IPEC-1增殖(細(xì)胞活率)的影響

3 討論

稀土具有廣譜抗菌性，稀土（Ce 和La）殼糖胺螯合鹽已被列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《飼料添加劑品種目錄（2013）》中，可用于畜禽、魚和蝦。不同來源稀土的抗菌性能存在差異，以稀土硝酸鹽與肉桂酸、8-羥基喹啉合成三種不同稀土配合物，同時(shí)合成三種不同稀土元素的吡啶羧酸類配合物，并開展抑菌試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同配合物形式的有機(jī)稀土和同一配合物不同稀土元素的有機(jī)稀土體外抑菌性能存在差異，稀土配合物的抑菌效果明顯優(yōu)于自由配體[13]。有關(guān)殼聚糖有機(jī)稀土的抑菌試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)稀土配合物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌性能比單一的水溶性殼聚糖顯著提高[8]，不同稀土離子殼聚糖配合物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌性能也存在差異[1]。為科學(xué)應(yīng)用稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽添加劑的抗菌性能作用，本試驗(yàn)評(píng)估了以一種稀土（鈰和鑭）殼糖胺螯合鹽為主要成分的有機(jī)稀土(REE)及其與植物甾醇復(fù)合物(REP)兩種添加劑的體外抑菌性能，結(jié)果高濃度(1 mg/ml)REE 和REP 對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用較強(qiáng)，抑菌效率均在90%以上。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)低濃度REP 抑菌效率低于REE 處理，這可能與有機(jī)稀土抑菌作用機(jī)制和REP 中所含植物甾醇有關(guān)。稀土對菌體確有氧化損傷作用并表現(xiàn)出一定的抑制作用和劑量效應(yīng)[13]，研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇具有提高機(jī)體抗氧化能力作用[15，17]，這可能是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度下REP 抑菌效率相對REE 較低的主要原因。

為評(píng)定有機(jī)稀土及其與植物甾醇復(fù)合物對細(xì)胞增殖的影響，本試驗(yàn)選用處于對數(shù)生長期的豬腸上皮細(xì)胞IPEC-1 進(jìn)一步開展試驗(yàn)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有高抑菌效率濃度(1 mg/ml、500 μg/ml)REE 和REP 處理均顯著抑制IPEC-1 細(xì)胞增殖，低抑菌作用濃度(50 μg/ml、10 μg/ml)REE 和REP 對IPEC-1 增殖均無抑制作用。高濃度REE 和REP 抑制IPEC-1 細(xì)胞增殖，與研究報(bào)道高濃度稀土抑制肝細(xì)胞增殖[18]相似。稀土對小鼠成纖維細(xì)胞生長的影響試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長的抑制作用隨稀土濃度增加顯著增強(qiáng)[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)50 μg/ml REP 處理組細(xì)胞活率顯著高于對照組，50 μg/ml REE 處理組與對照組無顯著性差異，而REP 復(fù)合物中有機(jī)稀土含量高于REE 組。這表明本試驗(yàn)條件下有機(jī)稀土對IPEC-1細(xì)胞增殖的影響可能受到植物甾醇的作用，與抑菌試驗(yàn)結(jié)果類似。植物甾醇具有抗氧化作用，可防止細(xì)胞氧化損傷[16]，關(guān)于適宜濃度下REP促進(jìn)IPEC-1細(xì)胞增殖的作用機(jī)制仍待于進(jìn)一步研究。

天然植物提取物在適宜條件下可促進(jìn)細(xì)胞增殖或緩解其他抑制細(xì)胞增殖因素的作用，體外MTT 細(xì)胞增殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，博落回生物堿在一定濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)豬腸上皮細(xì)胞增殖[20]，從莧科植物牛膝中提取的牛膝多糖能顯著促進(jìn)正常培養(yǎng)條件下豬腸上皮細(xì)胞增殖，也能顯著緩解脂多糖對細(xì)胞增殖的抑制作用[15]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度條件下REP 和REE 在體外抑菌效率和對豬腸上皮細(xì)胞增殖調(diào)控作用的差異，或許可為開發(fā)有機(jī)稀土和天然植物提取物在畜禽飼料中的復(fù)合應(yīng)用提供參考。高濃度有機(jī)稀土表現(xiàn)出較好的抑菌效果，同時(shí)也對豬腸上皮細(xì)胞增殖表現(xiàn)出抑制作用，將其與天然植物提取物復(fù)合在高濃度情況下仍表現(xiàn)較好的抑菌作用，在適宜濃度下可促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而有可能通過抑制腸道病菌、增加小腸消化吸收和免疫屏障等功能實(shí)現(xiàn)替代抗生素、提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

4 結(jié)論

①有機(jī)稀土(REE)及其與植物甾醇復(fù)合物(REP)對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效率隨濃度降低而顯著降低，高濃度下(1 mg/ml、100 μg/ml)REP和REE抑菌效率無明顯差異。

②高濃度有機(jī)稀土(REE)及其與植物甾醇復(fù)合物(REP)抑制腸上皮細(xì)胞IPEC-1 增殖，適宜濃度下(50 μg/ml) REP 顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，本試驗(yàn)下未見REE處理顯著促增殖作用。