周昀

摘?要：對茶渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉色素工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗基礎(chǔ)上，以硫酸銨、茶渣、大豆油添加量為影響因素，以紅曲色素總色價為響應(yīng)值，采用BoxBehnken中心組合試驗設(shè)計數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化茶渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉色素的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：影響茶渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉色素的因素大小依次為硫酸銨、大豆油、茶渣;茶渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉色素的最佳培養(yǎng)條件為硫酸銨添加量1.66%、茶渣添加量35.37%、大豆油添加量2.4%以及接種量3%，根據(jù)模型預(yù)測的總色價為（1076.4±30.2）U·g-1。進(jìn)行重復(fù)驗證試驗，經(jīng)測定實際所得總色價為1063 U·g-1，總色價實測值與回歸模型的預(yù)測值相對誤差1.26%，說明回歸方程與實際情況擬合較好。

關(guān)鍵詞：茶渣;紅曲霉;紅曲色素;固態(tài)發(fā)酵

中圖分類號：TS209?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）08-0001-06

Abstract： The technological conditions of producing the Monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were optimized. On the basis of the single factor experiment， with the ammonium sulfate， tea residue and soybean oil as the influencing factors and the total color value of Monascus pigment as the response value， the BoxBehnken central composite design was used to design a mathematical model， in order to optimize the culture conditions for the production of Monascus pigment by solidstate fermentation. The results showed that the factors affecting the production of monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were the ammonium sulfate， soybean oil and tea residue in order. The optimum culture conditions for producing the Monascus pigment by solidstate fermentation of tea residue were the ammonium sulfate （1.66%）， tea residue （35.37%）， soybean oil （2.4%） and inoculation amount （3%）. And the total color value predicted by the model was （1076.4±30.2）U·g-1. Then， the repeated verification tests were carried out and the actual total color value was determined to be 1063 U·g-1. The relative error between the measured value of total color value and the predicted value of the regression model was 1.26%， indicating that the regression equation fit well with the actual situation.

Key words： Tea residue; Monascus; Monascus pigment; Solidstate fermentation

紅曲霉產(chǎn)的紅曲色素作為一種天然色素，廣泛使用在食品加工業(yè)中[1]。紅曲色素目前已確定結(jié)構(gòu)的有紅曲紅、紅曲橙和紅曲黃3種，與其他色素相比具有降血脂、降血壓等生理活性，且穩(wěn)定性高，著色力強(qiáng)等優(yōu)勢[2]，開發(fā)色價高的紅曲色素成為近年來紅曲霉產(chǎn)物的研究熱點(diǎn)。與此同時，由于茶葉中含有較多的營養(yǎng)成分，作為傳統(tǒng)飲料，制作茶葉、茶飲料生產(chǎn)中產(chǎn)生了大量廢棄茶葉副產(chǎn)品。茶渣中保留了大量纖維素、木質(zhì)素、茶多酚、氨基酸及微量元素等有效成分，具有潛在利用價值[3]。福建省作為產(chǎn)茶大省，茶葉消費(fèi)副產(chǎn)品相當(dāng)巨大，茶渣等再利用的研究對促進(jìn)福建省農(nóng)業(yè)殘余產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本研究以茶渣為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉色素的工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為茶渣的合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試材料

1.1.1?菌種?紅曲霉菌株S2：由本實驗室篩選保藏。

1.1.2?主要儀器?6孔圓形深孔板（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）;T6型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;hh6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州金壇宏華儀器廠）;LRH生化培養(yǎng)箱（上海恒科學(xué)儀器公司）;VD850型潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）;YB500A高速多功能粉碎機(jī)（上海力箭機(jī)械有限公司）;Readmax1900全波長酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.1.3?主要試劑?可溶性淀粉、麥芽糖、蛋白胨、瓊脂、K2HPO4、NaNO3、KCl、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、硫酸銨、酵母浸粉、蔗糖、甘油、牛肉浸膏、70%乙醇（73.7 mL 95%乙醇用超純水定容到100 mL），均為國產(chǎn)分析純試劑。茶碎茶梗及豆粕購自網(wǎng)絡(luò)平臺，金龍魚食用油購自超市。

1.2?培養(yǎng)基

1.2.1?微量元素配方?0.3%NaNO3、0.1% ZnSO4·7H2O、0.1% MgSO4·7H2O、0.2%K2HPO4。

1.2.2?斜面培養(yǎng)基?PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮，切成小塊，稱200 g加水1 L，煮沸保持30 min，4層紗布過濾去渣，濾液加入瓊脂20 g、葡萄糖20 g，加熱溶解，定容至1 L。分裝到試管中，硅膠塞封口包扎好后于121℃高壓滅菌30 min。取出后試管擺斜面，冷卻后留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?固體發(fā)酵培養(yǎng)基?取20 g茶碎茶梗略粉碎后加少量超純水浸泡10 min后濾去水分得到茶渣，另加入45 g超純水及上述微量元素浸泡過夜，添加額外氮源后倒入250 mL三角燒瓶內(nèi)于121℃高壓滅菌30 min。使用6孔深孔板時，配置同等比例的料水后分別于每孔中添加8 g料水，121℃高壓滅菌30 min。

1.3?試驗方法

1.3.1?斜面培養(yǎng)及菌懸液的制備?保藏的紅曲霉接種于斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)箱中活化7 d;刮下斜面上孢子轉(zhuǎn)移到另一個含有10 mL的生理鹽水試管中，振蕩5 min形成菌懸液。

1.3.2?單因素試驗?單因素試驗均以單純茶渣固體培養(yǎng)基、不添加氮源及紅曲菌的樣品作為參比樣。

（1）不同氮源類型對紅曲霉產(chǎn)色素的影響。在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別額外添加1.5%的氮源（蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨及豆粕，其他氮源以蛋白胨含氮量折算）。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養(yǎng)7 d。

（2）不同氮源添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響。在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別額外添加1%、1.5%、2.5%和3%的（NH4）2SO4。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養(yǎng)7 d。

（3）不同茶渣添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響。在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用額外添加1.5%氮源硫酸銨，分別添加25%、30%、35%和40%茶碎茶梗。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養(yǎng)7 d。

（4）不同食用油添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響。在固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用額外添加1.5%氮源硫酸銨和35%的碳源茶碎茶梗，分別添加1%和2%大豆油。以1.5%接種量接入菌懸液，30℃下靜置培養(yǎng)7 d。

（5）不同接種量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響。在6孔板固體發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，采用額外添加1.5%硫酸銨（氮源）和35%茶碎茶梗（碳源），在每孔分別添加1%、3%、5%和10%菌懸液，30℃下靜置培養(yǎng)7 d。

1.3.3?茶渣培養(yǎng)基正交試驗?使用JMP13軟件設(shè)計BoxBehnken中心組合試驗，試驗設(shè)計因素及水平列于表1。以硫酸銨（氮源）、茶渣（碳源）和大豆油添加量為3個因子自變量，紅曲色素總色價為響應(yīng)值。使用JMP13軟件對響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析。

1.3.4?發(fā)酵產(chǎn)物色價的測定?取發(fā)酵物0.5 g，以超純水或70%乙醇定容至10 mL，60℃恒溫水浴鍋中浸提1 h后超聲振蕩及過濾。取濾液0.5 mL用超純水或70%乙醇適當(dāng)稀釋后分別在410、465、510 nm處測定吸光度值分別為黃、橙和紅的色價。6孔板培養(yǎng)時使用全波長酶標(biāo)儀進(jìn)行色價的測定，制備待測樣方法一致?？偵珒r=（OD410+OD465+OD510）×稀釋倍數(shù)[4]。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同氮源類型對紅曲霉產(chǎn)色素的影響

由圖1可知，無額外添加氮源的條件下紅曲霉產(chǎn)醇溶性和水溶性色素均很少，可能是因為茶葉本身的含氮量只有3.5%～4.5%[5]，經(jīng)過浸泡后流失部分水溶性氨基酸使殘留的茶蛋白含量更低，不足以支持紅曲霉對氮源的需求。水溶性色素產(chǎn)量甚少，故此后僅測定醇溶性色素含量。而各氮源對紅曲霉產(chǎn)醇溶色素的促進(jìn)作用為硫酸銨>牛肉浸膏>蛋白胨>酵母浸粉>豆粕，以唯一無機(jī)氮源硫酸銨的效果最佳，醇溶性色素的產(chǎn)量可達(dá)到274 U·g-1，為未添加額外氮源參比樣的5.5倍左右。有機(jī)氮源中牛肉浸膏的效果較好，但鑒于價格考慮，硫酸銨無疑是外加氮源的最佳選擇。

2.2?不同硫酸銨添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響

由圖2可知，硫酸銨添加量為1.5%時，3種醇溶性色素總產(chǎn)量可達(dá)222 U·g-1，低于或高于1.5%添加量都會造成醇溶性色素生成的減少。過高的氮源反而會抑制3種醇溶色素的產(chǎn)生，可能和促進(jìn)菌體生長而抑制了代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生有關(guān)。

2.3?不同茶渣添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響

由圖3可知，茶渣占發(fā)酵物總質(zhì)量的35%時，3種醇溶性色素的產(chǎn)量最高（紅色素191.4 U·g-1、橙色素109.8 U·g-1、黃色素62.2 U·g-1，總色素量363.4 U·g-1）。但茶渣量并非越多越好，當(dāng)其占比為40%時，由于水分含量降低且茶葉吸水性較強(qiáng)，導(dǎo)致發(fā)酵物較干，不利于紅曲霉的發(fā)酵，所產(chǎn)醇溶性色素比添加30%茶渣時低。

2.4?不同大豆油添加量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響

由于周波等[6]在之前的研究中發(fā)現(xiàn)使用食用植物油確實可以促進(jìn)液態(tài)發(fā)酵紅曲霉色素的產(chǎn)量，故在茶渣培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加了不同含量的大豆油進(jìn)行試驗。由圖4可知，添加植物食用油可以促進(jìn)紅曲霉產(chǎn)醇溶性色素，且隨著食用油添加量增加色素有增長的趨勢，在添加總量為2%的大豆油后醇溶性色素產(chǎn)量達(dá)到811 U·g-1。

2.5?不同接種量對紅曲霉產(chǎn)色素的影響

由圖5可知，過多接種量對于紅曲霉產(chǎn)色素不利，可能是菌株之間競爭營養(yǎng)抑制了色素的產(chǎn)生，這種效應(yīng)在容量較小的深孔板培養(yǎng)環(huán)境中體現(xiàn)得更加明顯，添加3%菌懸液時3種醇溶性色素的產(chǎn)量都達(dá)到峰值（總產(chǎn)量972 U·g-1）。

2.6?BoxBehnken中心組合試驗結(jié)果

2.6.1?回歸方程分析?BoxBehnken中心組合試驗設(shè)計結(jié)果列于表2。根據(jù)表2試驗結(jié)果，以總色價（Y）為響應(yīng)值，以標(biāo)準(zhǔn)最小二乘法進(jìn)行二次回歸方程擬合，得到總色價（Y）的回歸方程，即Y=-12218.014+3849.44X1+562.93X2+139.56X3-798.61X12-7.18X22-29.16X32 -33.89X1X2。

回歸分析及方差分析結(jié)果見表3，由表3可知，模型P<0.0001，表明回歸模型高度顯著。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.97，說明擬合程度極好，可用于后續(xù)茶渣發(fā)酵紅曲霉色素的產(chǎn)量預(yù)測所用。對回歸方程的各項方差進(jìn)一步檢驗可知，X1、X2、X3三因素對紅曲色素產(chǎn)量的影響強(qiáng)度順序為硫酸銨添加量（X1）>大豆油添加量（X3）>茶渣添加量（X2）。因素X1、X3及二次項

X12、X22、X32對總色價具有極顯著影響（P<0.01），因素X2及交互項X1X2對總色價具有顯著影響（P<0.05）。

2.6.2?響應(yīng)面雙因子效應(yīng)分析及預(yù)測刻畫器?從圖6～8的雙因子效應(yīng)分析中可知，3個因素的交互作用顯著，且根據(jù)JMP軟件特有的預(yù)測刻畫器可以調(diào)節(jié)相關(guān)因素得到預(yù)測的總色價。由圖9可得最佳培養(yǎng)條件為硫酸銨添加量1.66%、茶渣添加量35.37%、大豆油添加量2.4%以及接種量3%，根據(jù)此預(yù)測所得的總色價為（1076.4±30.2）U·g-1，與代入回歸方程所得總色價1076.37 U·g-1一致。

2.7?驗證試驗

為確定建立模型與試驗結(jié)果是否相符，采用最佳培養(yǎng)條件添加1.66%硫酸銨、35.37%茶渣和2.4%大豆油，接種量為3%時進(jìn)行可靠性重復(fù)試驗3次。經(jīng)測定實際所得紅曲霉色素總色價為1063 U·g-1，與模型預(yù)測范圍相差不大，說明模型設(shè)計合理，預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確。

3?結(jié)論

本研究采用單因素試驗對氮源類型、硫酸銨、茶渣、大豆油添加量及接種量進(jìn)行篩選研究，試驗結(jié)果表明外加氮源能明顯促進(jìn)茶渣培養(yǎng)基中紅曲霉產(chǎn)色素，其中硫酸銨的效果最為明顯，而醇溶性色素的產(chǎn)量又明顯高于水溶性色素，硫酸銨添加量為1.5%時所產(chǎn)醇溶性色素最高。茶渣作為唯一的碳源，其添加量在35%時醇溶性色素產(chǎn)量最高，說明紅曲菌具有分解纖維素和木質(zhì)素轉(zhuǎn)變成還原糖的能力，其纖維素酶活性的測定是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)。添加食用大豆油確實會增加醇溶性色素的產(chǎn)量，且產(chǎn)量與添加量成正比。在單因素試驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化茶渣固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲霉素工藝條件為硫酸銨1.66%、茶渣35.37%、大豆油2.4%及接種量3%，在此最佳工藝條件下紅曲霉產(chǎn)醇溶性色素可達(dá)1063 U·g-1。茶渣色素產(chǎn)量與其他糧食類固體培養(yǎng)基的色素產(chǎn)量[7]相比較低，這可能是因為糧食類培養(yǎng)基的碳源利用更加容易，而茶渣中的碳水化合物以纖維素為主。在今后研究中可考慮添加外源性纖維素酶提高茶渣培養(yǎng)基的利用率。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）