陳燕萍 劉欣 肖榮鳳 朱育菁 劉波

摘?要：對(duì)福建省4個(gè)地區(qū)種植西瓜實(shí)生苗田塊的枯萎病發(fā)病率進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明：西瓜枯萎病的田間平均發(fā)病率在18.5%～38.2%。從不同地點(diǎn)采集的發(fā)病植株上共分離、純化和保存了31株菌株，結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)特征、鐮刀菌屬特異引物Fu3/Fu4和尖孢鐮刀菌特異性引物FOF1/FOR1檢測(cè)以及致病性測(cè)定，確定了尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum為福建省西瓜枯萎病的主要病原菌，其中尖孢鐮刀菌占總分離菌株數(shù)量的93.54%。

關(guān)鍵詞：西瓜;枯萎病;發(fā)病率;病原鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S651?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）08-0032-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.08.007

Abstract： The incidence of Fusarium wilt in the fields of planting the watermelon seedlings at the 4 regions of Fujian Province was investigated. The results showed that the average incidences of Fusarium wilt was from 18.5% to 38.2% in the different fields. A total of 31 strains were isolated， purified and preserved from the diseased plants collected from the different sites. Fusarium oxysporum was identified as the main pathogen of Fusarium wilt of watermelon in Fujian Province based on the morphological characteristics， PCR amplification of the specific primers Fu3/Fu4 for Fusarium gene and FOF1/FOR1 for Fusarium oxysporum， and the pathogenicity test. And Fusarium oxysporum accounted for 93.54% of the total number of isolated strains.

Key words： Watermelon; Fusarium wilt; Incidence; Pathogen identification

西瓜是福建省的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)福建省西瓜年均栽培面積約3.5萬(wàn)hm2以上，產(chǎn)量約130萬(wàn)t以上[1]。隨著西瓜種植年限的增加，連作障礙愈發(fā)凸顯。其中，由土傳病原菌引起的西瓜枯萎病發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，普遍發(fā)病率為10%～30%，嚴(yán)重者高達(dá)50% 以上甚至絕產(chǎn)[2-3]?？菸≡谖鞴险麄€(gè)生育期均可發(fā)生，以伸蔓期至開(kāi)花坐果期發(fā)病最為嚴(yán)重[4]。已有研究對(duì)西瓜枯萎病病原菌進(jìn)行了分離與鑒定，研究結(jié)果表明，從病株上可分離獲得尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum、茄病鐮刀菌F.solani和串株鐮刀菌F.moniliforme等鐮刀菌屬菌株，但均表明尖孢鐮刀菌是其主要病原菌[3，5]。由于鐮刀菌屬種類(lèi)繁多、形態(tài)各異，僅依靠形態(tài)特征難以對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類(lèi)鑒定。近年來(lái)，利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列rDNAITS、翻譯延伸因子EF1α

和RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基rPB2等基因位點(diǎn)的核酸序列進(jìn)行PCR測(cè)序?yàn)殓牭毒鷮俜N類(lèi)的準(zhǔn)確鑒定提供了便利[6-8]。但是，鐮刀菌屬特異引物Fu3/Fu4和尖孢鐮刀菌特異性引物FOF1/FOR1，可分別快速、批量、準(zhǔn)確地鑒定到鐮刀菌屬水平以及尖孢鐮刀菌種水平[9-10]。因此，為了解福建省西瓜枯萎病的發(fā)病情況和主要病原菌種類(lèi)，本研究調(diào)查了福建省內(nèi)多地的西瓜枯萎病的發(fā)病情況，并通過(guò)形態(tài)學(xué)、特異性引物分子鑒定及致病性測(cè)定等方法，進(jìn)行西瓜枯萎病病原菌的種類(lèi)鑒定。

1?材料與方法

1.1?供試材料

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g，定容至1000 mL;真菌基因組DNA的提取試劑盒（DP2031）購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;2×EasyTaq PCR SuperMix購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司;所用引物均由上海博尚有限公司合成。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?西瓜枯萎病田間發(fā)病率調(diào)查及采樣?2017-2020年間，調(diào)查福建省三明市泰寧縣（山地，新地），福州市平潭縣（沙灘地，輪作1年）、瑯岐鎮(zhèn)（水田，輪作1年）和永泰縣（水田，輪作2年）等地西瓜主要種植區(qū)的西瓜枯萎病發(fā)生情況與病害癥狀，調(diào)查面積為2000～3335 m2。并采集西瓜枯萎病發(fā)病初期的病株樣本帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

1.2.2?病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定?采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病菌分離。從不同地點(diǎn)采集的西瓜病株截取地上部距離土面3～5 cm處的莖部組織，切取病健交界處組織塊各30片，每片約為0.5 cm×0.3 cm×0.1 cm大小的薄片，經(jīng)75%酒精處理2～3 s，再用1%次氯酸鈉處理3～5 min后，用無(wú)菌水清洗3遍，置于含200 μg·mL-1硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每皿放5片病組織，于（25±1.5）℃培養(yǎng)2～3 d;從不同地點(diǎn)采集的分離平板中隨機(jī)挑選典型特征的分離物，接種于新的PDA平板上，并經(jīng)單孢分離獲得純培養(yǎng)，菌株編號(hào)后于-80℃甘油冷凍保存。形態(tài)學(xué)鑒定參照Leslie等的方法[11]：在PDA培養(yǎng)基接種病原菌純培養(yǎng)物，25℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征，于顯微鏡下觀察分生孢子的種類(lèi)和形態(tài)，并測(cè)量病原菌的孢子大小。

1.2.3?病原菌的分子鑒定?取培養(yǎng)7 d的各菌株菌絲體參照真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌株總DNA提取。

鐮刀菌屬的鑒定[9]：采用鐮刀菌鑒定的特異性 引物Fu3/Fu4序列CCGAGTTTACAACTCCCAAA/TCCTCCGCTTATTGATATGC進(jìn)行菌株DNA的PCR擴(kuò)增，目的片段約為520 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL，引物各1 μL（10 μmol·L-1），DNA模板1 μL，用ddH2O定容至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

尖孢鐮刀菌種的鑒定[10]：采用尖孢鐮刀菌鑒定的特異性引物FOF1/FOR1序列ACATACCACTTGTTGCCTCG/CGCCAATCAATTTGAGGAACG進(jìn)行菌株DNA的PCR擴(kuò)增，目的片段約為340 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12 μL，引物各1 μL（10 μmol·L-1），DNA模板1 μL，用ddH2O定容至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性60 s;94℃變性60 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸60 s，共25個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

1.2.4?病原菌的致病性測(cè)定?保存的各菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后分別配成濃度為1.0×106 cfu·mL-1孢子懸浮液，采用傷根澆灌法接種西瓜植株，植株大小以地上部株高約為10 cm，每株澆菌液20 mL，以清水處理為對(duì)照，各菌株處理30株，置于25～28℃的溫室中進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率，從發(fā)病株上重新分離病原物，并根據(jù)1.2.3進(jìn)行病原菌鑒定。

2?結(jié)果與分析

2.1?西瓜枯萎病田間發(fā)病率調(diào)查及采樣

西瓜枯萎病苗期即可開(kāi)始發(fā)病，開(kāi)花結(jié)果期至果實(shí)成熟期發(fā)病最為嚴(yán)重。發(fā)病初期田間癥狀表現(xiàn)為病株莖蔓上葉片自基部向前逐漸萎蔫，似缺水狀，早晚尚能恢復(fù)正常;發(fā)病中期萎蔫不可恢復(fù)，葉片和莖蔓萎蔫，根部及根莖部表皮組織輕微開(kāi)裂，維管束呈淺褐色;發(fā)病后期根部壞死，莖表皮完全開(kāi)裂褐變，維管束壞死，整株枯死（圖1）。不同地區(qū)種植西瓜實(shí)生苗枯萎病的田間平均發(fā)病率調(diào)查結(jié)果表明，泰寧縣山地種植的發(fā)病率為18.5%，平潭縣沙灘地種植的發(fā)病率為25.8%，瑯岐鎮(zhèn)大棚種植的發(fā)病率達(dá)38.2%，永泰縣水田種植的發(fā)病率20.6%。

2.2?病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

經(jīng)單孢分離，挑取有代表性的31個(gè)菌株進(jìn)行-80℃冷凍保存。所分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d，菌絲體白色棉絮狀（圖2A）。產(chǎn)孢細(xì)胞短，單瓶梗（圖2B）;小型分生孢子呈橢圓形或卵圓形，0～1個(gè)隔膜，大小9.8（6.2～20.7）μm×2.6（2.1～3.7）μm;大型分生孢子鐮刀形或紡錘形，有足胞，1～4個(gè)隔膜，多為3個(gè)隔膜，大小為30.3（22.8～39.9）μm×3.6（3.2～5.5）μm（圖2C）。初步確定這些分離物為鐮刀菌（Fusarium spp.）。

2.3?病原菌的分子鑒定

對(duì)從不同地區(qū)采集的31株西瓜枯萎病病原菌進(jìn)行屬、種分子鑒定，結(jié)果（表1）表明，采用鐮刀菌Fu3/Fu4特異性引物鑒定，供試菌株均獲得1條大小約為520 bp的條帶，與目的片段大小相似，證明供試菌株均為鐮刀菌（圖3A）;進(jìn)一步利用尖孢鐮刀菌特異性引物FOF1/FOR1鑒定，除菌株FJAT30281和FJAT30288外，其余菌株均獲得1條大小約為340 bp的條帶，與目的片段大小相似，證明這29株菌株均為尖孢鐮刀菌，尖孢鐮刀菌占總數(shù)的93.54 %（圖3B）。

2.4?病原菌的致病性測(cè)定

供試菌株采用傷根澆灌接種回接西瓜實(shí)生苗，結(jié)果表明菌株的致病性存在差異（圖4）。菌株FJAT30281和FJAT30288（非尖孢鐮刀菌）處理組和對(duì)照組植株不發(fā)病;其余供試菌株均可使西瓜植株發(fā)病，但發(fā)病率有差異，接種7 d后不同菌株處理組陸續(xù)開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為下部葉片先呈現(xiàn)萎蔫癥狀;接種14～18 d，17個(gè)強(qiáng)致病性菌株處理組植株完全萎蔫，發(fā)病率均達(dá)100%;另外12個(gè)菌株處理組接種25 d后仍有部分植株未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，發(fā)病率在60.00%～93.33%（圖5A）。致病菌株處理的植株根莖部出現(xiàn)褐變且橫切后莖部維管束可見(jiàn)明顯褐變，而清水對(duì)照CK處理組的植株未變色（圖5B、5C）。重新分離均獲得與接種物相同的分離物，符合柯赫氏法則。

3?討論

西瓜枯萎病在我國(guó)西瓜產(chǎn)區(qū)均可發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重程度會(huì)因種植地區(qū)、種植方式和品種等差異而不同[3，12-13]。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)福建省內(nèi)4個(gè)地區(qū)的西瓜枯萎病平均發(fā)病率存在差異，平均發(fā)病率在18.5%～38.2%，可能與不同地區(qū)土壤類(lèi)型、氣候特點(diǎn)和品種有關(guān)。從不同地區(qū)采集的西瓜枯萎病株上分離純化的31株菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)、特異性引物分子檢測(cè)及致病性測(cè)定等方法，確定了尖孢鐮刀菌為福建省西瓜枯萎病的主要病原菌，其中尖孢鐮刀菌占總分離菌株數(shù)量的93.54 %，另外也分離到2株其他鐮刀菌，與紀(jì)莉景等[3]以及杜若琛等[5]的研究結(jié)果類(lèi)似。紀(jì)莉景等[3]研究表明，從西瓜枯萎病發(fā)病初期的病組織中分離得到尖孢鐮刀菌的概率較大，而發(fā)病后期整株植株完全萎蔫時(shí)，還有可能分離少量其他腐生菌。本研究從4個(gè)地點(diǎn)采集的田間初發(fā)病植株，除泰寧地區(qū)樣本中分離到2株非尖孢鐮刀菌外，其余3個(gè)地點(diǎn)分離的菌株均為尖孢鐮刀菌，同樣證明了從初發(fā)病植株更容易獲得尖孢鐮刀菌。根據(jù)以往分離鑒定經(jīng)驗(yàn)，地下根莖部及靠近土面的莖部組織中容易分離到其他腐生菌，離土面越遠(yuǎn)的組織分離到強(qiáng)致病菌株的概率越大，本研究采用的是截取植株地上部距離土面3～5 cm處的莖部組織進(jìn)行分離，因此，分離到的尖孢鐮刀菌數(shù)量較高。除了傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法，本研究主要采用鐮刀菌屬和尖孢鐮刀菌種類(lèi)的特異引物鑒定，使得病原菌的鑒定結(jié)果更為可靠，鑒定效率更高，可為病原菌快速鑒定和田間西瓜枯萎病的防治提供技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）