張知曉 季梅 戶(hù)連榮 劉凌

摘要：在云南省10個(gè)核桃主產(chǎn)區(qū)開(kāi)展了核桃果實(shí)病害調(diào)查，對(duì)所采集的病果標(biāo)本進(jìn)行了切片觀(guān)察及鑒定。結(jié)果表明，在云南省幾個(gè)核桃主產(chǎn)區(qū)中，大理市和楚雄市病害發(fā)生較普遍;核桃果實(shí)病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主;果實(shí)病原菌隸屬于17屬17種，其中，盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢、殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌、廣布擬盤(pán)多毛孢4種真菌出現(xiàn)率最高。

關(guān)鍵詞：核桃;果實(shí);病害調(diào)查;病原鑒定;云南省

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.64

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（ 2020） 20-0091-05

D01：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.020

核桃（Juglans regia）學(xué)名胡桃，是多年生落葉喬木，核桃仁是高檔堅(jiān)果，其種殼能開(kāi)發(fā)成工藝品，木材是制作高檔家具的原料，其葉子及果皮可以人藥。因其良好經(jīng)濟(jì)社會(huì)價(jià)值，云南省將胡桃作為發(fā)展八大產(chǎn)業(yè)的重要物種，是打造云南省綠色食品的重要組成部分[1]。近些年來(lái)，核桃的種植面積快速增加，有數(shù)據(jù)顯示，截至2017年，云南省核桃種植面積達(dá)286.67萬(wàn)hm2，核桃（干果）總產(chǎn)量為115萬(wàn)t，產(chǎn)值318億元，居全國(guó)第一[2]。據(jù)報(bào)道，中國(guó)為害核桃的病害種類(lèi)多達(dá)30余種。在云南省，核桃黑斑病、炭疽病、枝枯病及根腐病等發(fā)生普遍，已成為制約全省核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展和高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要瓶頸[3]。

核桃果實(shí)病害是影響核桃產(chǎn)量與質(zhì)量的直接因素，迄今為止，國(guó)內(nèi)對(duì)核桃果實(shí)病害的研究主要集中在炭疽病和黑斑病等病害的病原鑒定及防治方面[4.5]。而云南省關(guān)于核桃果實(shí)病害種類(lèi)、發(fā)生狀況、分布、危害等全面系統(tǒng)的研究未見(jiàn)報(bào)道。鑒于植物病害的癥狀相似性很高，在一類(lèi)病害發(fā)生時(shí)，不是僅出現(xiàn)由單一病原菌引起的單一病害，而是出現(xiàn)由多種病原菌引起的相同或不同病害癥狀[6]。因此，有必要明確核桃果實(shí)病害的發(fā)生種類(lèi)、病原菌及其特點(diǎn)，這是開(kāi)展病害綜合防控的基礎(chǔ)。本研究針對(duì)云南省10個(gè)核桃主產(chǎn)區(qū)的核桃果實(shí)病害進(jìn)行較全面地野外調(diào)查及真菌病原形態(tài)鑒定，以期較全面地了解云南省核桃主產(chǎn)區(qū)果實(shí)病害發(fā)生危害現(xiàn)狀及病原菌種類(lèi)，為云南省核桃病害的防治提供依據(jù)，以促進(jìn)核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

病害標(biāo)本 于2015年5月至2016年8月，以踏查為主分別在云南省核桃主產(chǎn)區(qū)的昆明市、昭通市、曲靖市、楚雄市、大理市、保山市、怒江市、臨滄市、文山市以及麗江市進(jìn)行病害調(diào)查，采集核桃病果標(biāo)本并記錄病害發(fā)生的特點(diǎn)和癥狀。

1.1.2培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、無(wú)菌水1L，用于病原真菌培養(yǎng)及對(duì)峙培養(yǎng)。

真菌分離培養(yǎng)基：PDA+青霉素50 |g/mL。

細(xì)菌分離培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaC15 g、瓊脂20 g、無(wú)菌水1L，pH 7.2-7.4。

1.2方法

1.2.1 病組織切片及觀(guān)察對(duì)新鮮病害標(biāo)本病癥明顯部位進(jìn)行拍照和描述，制作切片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察病原形態(tài);對(duì)子實(shí)體尚不明顯的病果材料進(jìn)行保濕，待子實(shí)體長(zhǎng)出后，再做切片觀(guān)察。

1.2.2 病原菌的分離培養(yǎng)采用組織分離法進(jìn)行果實(shí)病原菌的分離。用75%乙醇溶液對(duì)供試材料進(jìn)行表面消毒，在病健交界處切取一定大小的組織，接人加有抗生素的PDA培養(yǎng)基平板上。每皿接人3塊分離材料后將其置于（25±2）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在新的PDA平板上進(jìn)行純化，直至獲得純菌落，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

1）病部切片鑒定。于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察切片上病原菌子實(shí)體在植物組織上的著生位置、載孢體、產(chǎn)孢細(xì)胞及孢子的形狀、顏色等并進(jìn)行大小計(jì)測(cè)。孢子大小的測(cè)量一般不少于30個(gè)孢子，并查閱相關(guān)文獻(xiàn)，進(jìn)行種類(lèi)鑒定。

2）純菌種培養(yǎng)物的鑒定。采用培養(yǎng)性狀和微觀(guān)形態(tài)特征相結(jié)合進(jìn)行鑒定。將分離保藏的純菌株分別轉(zhuǎn)入PDA平板上，于25℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并定期觀(guān)察記錄菌落生長(zhǎng)狀況（包括菌落形態(tài)、顏色、質(zhì)地及生長(zhǎng)和產(chǎn)孢速度等）并拍照。當(dāng)菌落產(chǎn)孢后，挑取孢子梗、孢子等以無(wú)菌水作浮載劑制片，對(duì)于腔孢菌類(lèi)、子囊菌等還需將子實(shí)體制作成切片鏡檢，然后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察各菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征、產(chǎn)孢方式及孢子形態(tài)、顏色等，同時(shí)計(jì)測(cè)載孢體、產(chǎn)孢細(xì)胞、孢子等的大小，最后依據(jù)所觀(guān)測(cè)的各菌株宏觀(guān)和微觀(guān)形態(tài)特征，查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定其歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害調(diào)查情況

從云南省核桃主產(chǎn)區(qū)采集核桃果實(shí)病害標(biāo)本803份，如圖l所示，各地標(biāo)本采集數(shù)量差異較大，標(biāo)本采集數(shù)量的多少在一定程度上可反映核桃不同栽種區(qū)果實(shí)病害發(fā)生的普遍性。采集數(shù)量最多的是大理市，達(dá)203份，占總采集標(biāo)本數(shù)的25.3%;其次為楚雄市，共采集到185份標(biāo)本，占總采集標(biāo)本數(shù)的23.0%;標(biāo)本采集數(shù)較少的地區(qū)有昆明市（16份）、麗江市（21份）和文山市（4份）。

經(jīng)調(diào)查，云南省核桃果實(shí)病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主。將所采集的標(biāo)本進(jìn)行組織切片和分離純化，分離的培養(yǎng)物鑒定出的病原真菌與病部切片鑒定相吻合，盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢的出現(xiàn)率最高，為16.33%，其次是殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌、廣布擬盤(pán)多毛孢、胡桃盤(pán)二孢、核桃黃單胞菌，出現(xiàn)率分別為10.25%、11.47%、10.83%、9.64%和9.84%。出現(xiàn)率較低的菌株為殼二孢屬之一種、成團(tuán)泛菌2種（表1）。

2.2主要病害的發(fā)生危害及病原形態(tài)學(xué)鑒定

2.2.1 核桃炭疽病

1）癥狀。如圖2A所示，感病果實(shí)皮部出現(xiàn)褐色至黑褐色、圓形或近圓形的病斑，中央凹陷，病部有黑色小點(diǎn)產(chǎn)生，有時(shí)呈輪狀排列，濕度大時(shí)可溢出粉紅色的分生孢子角。發(fā)病嚴(yán)重的果實(shí)病斑擴(kuò)大連片，病部皺縮，全果可發(fā)黑腐爛。

2）病原形態(tài)特征。如圖2B至2D所示，核桃炭疽病病原分生孢子盤(pán)散生，直徑為122.0-244.0 μm，黑褐色，盤(pán)內(nèi)有較少的暗褐色剛毛。短小的分生孢子梗密生于盤(pán)內(nèi)，無(wú)色，產(chǎn)孢方式為內(nèi)壁芽生瓶體式（ eb-ph），分生孢子圓柱形，長(zhǎng)橢圓形，大小為（7.5-17.5）μmx（ 2.5-5.0）μm，單胞，無(wú)色。菌落淺褐色，絨狀，邊緣產(chǎn)黑色小點(diǎn)，為病原菌的分生孢子盤(pán)，有時(shí)可溢出橘黃色的分生孢子角，后期產(chǎn)子囊殼;菌落背面為黑灰色，有黑色斑點(diǎn);培養(yǎng)基平板不變色。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌為盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢。

有性態(tài)如圖3所示，子囊殼球形、近球形、瓶形，大小為（ 80.0-170.0） μmX （60.0-150.0） μm，常聚生。子囊棒狀，大小為（37.0-50.0） μmx（7.5-10.0）μm，無(wú)柄。子囊孢子橢圓形，大小為（12.5-17.5） μmx（4.0-5.0）μm，單胞，無(wú)色。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌有性態(tài)為圍小叢殼（Glomerella cigulata）。

3）流行病學(xué)研究。病原菌以菌絲體、分生孢子盤(pán)或子囊殼在病果及病葉上越冬。次年，孢子成熟，并借風(fēng)雨傳播侵染。果實(shí)的炭疽在夏季，降雨量較集中時(shí)發(fā)病較重。栽植密度過(guò)大、樹(shù)冠稠密、通風(fēng)透光不良的核桃園發(fā)病較重。葉部也可受害。

4）分布。云南省昆明市、曲靖市、大理市;其有性態(tài)見(jiàn)于曲靖市。

2.2.2 核桃枯果病

1）癥狀。如圖4A所示，感病果實(shí)形成較大面積的黃褐色病斑，果皮干枯，不規(guī)則開(kāi)裂。

2）病原。如圖4B至圖4E所示，子座埋生于寄主表皮下，大小為（ 214.0-590.0）μmX（ 122.0-203.0）μm，內(nèi)埋生不規(guī)則形、半圓形、球形的分生孢子器，大小為[（ 70.0-）120.0-450.0（ -550.0）]μmx[ （40.0-）80.0-190.0（-300.0）] μm;分生孢子梗圓柱形，少有隔，無(wú)色，全壁芽生單生式（ hb-sol）產(chǎn)孢。分生孢子頂生，梭形，大小為[（ 2.5-） 5.0-11.0]μmx（ 2.5-4.0）μm，單胞、無(wú)色，有時(shí)具油滴。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌為殼梭孢屬之一種。

3）流行病學(xué)研究。病原菌以菌絲體和子座在病殘?bào)w上越冬。次年春，分生孢子借風(fēng)雨傳播，侵染。主要為害枝條，葉片、果實(shí)也可受害。

4）分布。云南省曲靖市、大理市、保山市、臨滄市。

2.2.3 核桃果腐病 由不同病原菌所引起的果腐都在果實(shí)上形成變色的病斑，中部凹陷或不凹陷，大多數(shù)果肉已開(kāi)始腐爛。

1）病原一的癥狀、病原、流行病學(xué)研究及分布如下。

①癥狀。如圖5A所示，感病果實(shí)果皮出現(xiàn)紫黑色、近黑色病斑，逐漸擴(kuò)大并凹陷，其上可見(jiàn)密集的黑色小點(diǎn)，為病原菌的子座和分生孢子器;后期果皮皺裂，內(nèi)部果肉隆起外露，密生黑色小顆粒，為病原菌有性態(tài)的子座和假囊殼。

②病原。如圖SB所示，假囊殼聚生，初埋生于子座，后突破子座外露，近球形，有的具喙，假囊殼大小為（100.0-175.0）μmx（ 68.0-150.0） μm。子囊棍棒形，大小為（42.0-57.5）μmx（7.5-12.5）μm，無(wú)色;子囊孢子不夠成熟。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌為葡萄座腔菌。

無(wú)性態(tài)：群生小穴殼的分生孢子器球形、近球形，大小為（ 130.0-230.0）μmX（ 100.0-200.0）μm，多個(gè)聚于子座。分生孢子梗短，分生孢子梭形、長(zhǎng)橢圓形，大小為[ 17.5-25.0（-30.0）] μmX [6.0-7.5 （-8.5）]μm，單胞、無(wú)色。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌無(wú)性態(tài)為群生小穴殼（圖5C至圖5E）。

③流行病學(xué)研究。核桃園內(nèi)有由該病原菌所致潰瘍?。ǜ筛。?，故病原菌既可在病果、病落果上，也可在病枝上越冬。次年春，氣候適宜時(shí)，子囊孢子成熟并傳播侵染。分生孢子可作為再侵染源，重復(fù)侵染。

④分布。云南省臨滄市;其無(wú)性態(tài)群生小穴殼分布于云南省楚雄市、保山市。

2）病原二的癥狀、病原、流行病學(xué)研究及分布如下。

①癥狀。如圖6A所示，病果出現(xiàn)灰黑色、黑色病斑，且皮部開(kāi)裂，表生黑色小粒點(diǎn)，為病原菌的分生孢子盤(pán);后期病斑幾乎擴(kuò)大至全果，呈暗褐色，皺縮凹陷，果腐并干枯，出現(xiàn)黑色小粒點(diǎn)，為病原菌的子囊殼。

②病原。如圖6B至圖6E所示，分生孢子盤(pán)初埋生，后突破寄主表皮，直徑為126.0-224.0（ -357.0）μm。分生孢子梭形，大小為[15.0-21.5 （-25.0）]μmx [5.0-5.5（ -7.5）]μm，有4個(gè)隔膜（隔膜處略縊縮或不縊縮），使其成為5個(gè)細(xì)胞。其中，兩端細(xì)胞無(wú)色，中間3個(gè)細(xì)胞同色，均為淺褐色，大小為9.0-15.0μm;孢子頂端具3-5根細(xì)長(zhǎng)的附屬絲，長(zhǎng)為5.0-12.5（ -15.0） μm，基部具l根附屬絲。菌落絨狀，白色，較厚，具環(huán)紋或無(wú)，后期表面可產(chǎn)黑色顆粒狀物，為病原菌的分生孢子盤(pán)，可溢出黑色黏液，為病原菌的分生孢子;菌落背面呈淺黃色至淺褐色，具黑色斑點(diǎn)。培養(yǎng)基平板不變色。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌為廣布擬盤(pán)多毛孢。

有性態(tài)：如圖7A至圖7C所示，子囊殼為瓶形、近球形，大小為（150.0-190.0） μmx（100.0-164.O）μm，淺褐色，具孔口。子囊棒狀，大小為（50.0-68.0）μmx7.5 μm，無(wú)色，其間有側(cè)絲。子囊孢子橢圓形，有的兩端略尖，直或微彎，大小為[ 10.0-12.5（ -15.0）]μmx[4.0-5.0（-7.5）]μm，具2個(gè)隔膜，即3胞，淺褐色，隔膜色較深。依據(jù)形態(tài)確定該病原菌有性態(tài)為胡桃多毛殼孢。

③流行病學(xué)研究。病菌以菌絲體、分生孢子盤(pán)或子囊殼在病株及病殘?bào)w上存活越冬，于次年春，孢子借風(fēng)雨傳播，從傷口或孔口侵入致病。每年4-9月發(fā)病，夏季高溫有利于該病害的發(fā)生。

④分布。云南省曲靖市、楚雄市、大理市、臨滄市;其有性型僅見(jiàn)于大理市和臨滄市。

3 小結(jié)與討論

本研究表明，云南省核桃果實(shí)病原菌多樣性豐富，且各地存在差異。各地核桃病果標(biāo)本采集數(shù)量在一定程度上反映病害發(fā)生的普遍性，在云南省幾個(gè)核桃主產(chǎn)區(qū)中，大理市和楚雄市病害發(fā)生較普遍，這與不同地區(qū)的氣候條件、核桃品種、樹(shù)齡及核桃種植地的立地條件和管護(hù)等都有密切關(guān)系[7，8]。云南省核桃果實(shí)病害以炭疽病、果腐病、枯果病和黑斑病為主。病果共鑒定出病原菌17種，隸屬于17個(gè)屬，其中，僅鏈格孢屬、刺盤(pán)孢屬[6]、擬盤(pán)多毛孢屬[9]、泛菌屬及黃單胞菌屬[10]5個(gè)屬曾作為核桃果實(shí)病害的病原菌被報(bào)道。雖然這些病原菌分離鑒定自果實(shí)的發(fā)病部位，但要確定它們是核桃果實(shí)病害的病原菌，還有待通過(guò)科赫法則進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

出現(xiàn)率最高的4種病原真菌為盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢、殼梭孢屬之一種、葡萄座腔菌及廣布擬盤(pán)多毛孢，其中，盤(pán)長(zhǎng)孢狀刺盤(pán)孢能夠引起核桃果實(shí)炭疽病這一結(jié)論與王清海等[11]的研究一致，而其他3種也均作為核桃葉部及枝干病原菌被報(bào)道[12，13]，表明在葉片及枝干上引起病害的病原真菌，在核桃果實(shí)上同樣可引起病害。此外，隋韻靜[14]還從陜西省核桃果仁水腐病的感病植株分離出一株蒼白桿菌（Ochrobactrum pimitosum]，而該菌種在本次調(diào)查中并未發(fā)現(xiàn)。

由于果實(shí)發(fā)病后直接使其失去食用和商品價(jià)值，且在貯運(yùn)過(guò)程中病果病原菌會(huì)迅速傳播再侵染，導(dǎo)致更多的健康果實(shí)受到侵染，造成大量鮮果腐爛。因此，核桃果實(shí)病害需引起重視。有效降低病害發(fā)生與危害是一切研究的目標(biāo)，而病害的準(zhǔn)確識(shí)別和明確其生物學(xué)特性是建立植物病害防治措施的前提和基礎(chǔ)。因此，核桃果實(shí)病害的識(shí)別和分離培養(yǎng)具有重要意義。為有效降低病害的發(fā)生，可采取以下措施：第一，因地制宜，選用適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的核桃抗病品種，合理施肥;第二，加強(qiáng)果園管理，清除病果、病枝和病葉，并集中燒毀或深埋?？茖W(xué)修剪，改善通風(fēng)透光條件;第三，除了物理防治、農(nóng)業(yè)防治措施外，也可在病害發(fā)生的不同時(shí)期科學(xué)施用安全、高效的化學(xué)藥劑進(jìn)行防治。

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作者簡(jiǎn)介：張知曉（1988-），女，云南個(gè)舊人，助理研究員，碩士，主要從事森林保護(hù)研究，（電話(huà)）13529349411（電子信箱）36062613@qq.com;

通信作者，劉凌（1981-），女，云南曲靖人，副研究員，博士，主要從事森林保護(hù)研究，（電子信箱）liuling_km@ 126.com。