阮謙 劉應(yīng)華 趙謙 王蕾 尹革芬

摘 要：鑒于牛流行熱（Bovine Ephemeral Fever，BEF）對養(yǎng)牛行業(yè)的危害以及熒光定量PCR技術(shù)高效、快速、精準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)，本研究針對牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）G基因建立熒光定量PCR檢測方法。并用所建立的熒光定量PCR檢測方法對臨床采集的樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：在GenBank數(shù)據(jù)庫中對BEFV全基因組序列進(jìn)行比對分析，找出保守序列，設(shè)計(jì)1對擴(kuò)增BEFV G基因片段的引物，通過分子克隆構(gòu)建重組質(zhì)粒制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率是95.1%，用所建立的方法檢測臨床樣本，陽性15份，陽性率為75%。該試驗(yàn)成功建立了檢測BEFV的熒光定量PCR檢測方法，證明云南省的牛場中廣泛存在BEFV，建立的熒光定量PCR檢測方法對BEFV的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查等具有應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：牛流行熱病毒;熒光定量PCR;檢測方法

牛流行熱（Bovine Ephemeral Fever，BEF）是由牛流行熱病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）引起牛機(jī)體內(nèi)部溫度突然升高、呼吸困難、腸胃功能異常、全身無力、不靈活和行動(dòng)異常的一種傳染疾病。該病傳播速度極快，很多地方的牛群都難避免，并且流行具有一定的周期性。BEF可導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量下降，妊娠奶牛出現(xiàn)流產(chǎn)，會給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。該病大多發(fā)生在夏、秋蚊子活躍期，雨季或晝夜溫差大容易引起流行[4]。健康牛被蚊蟲叮咬后，如果該蚊蟲叮咬過病牛，即會感染。目前，BEFV被歸入彈狀病毒科，病毒外型為子彈型，核酸為單股負(fù)鏈RNA，有5種結(jié)構(gòu)蛋白，對脂類物質(zhì)敏感[5-6]。

據(jù)近年來的相關(guān)報(bào)道，BEF對牛群的危害日趨嚴(yán)重，所以需要建立一種實(shí)用、敏感且快速便捷的分子檢測方法，以便做到早確診、早隔離、早治療，最大限度地降低BEF帶來的損失[7]。為了滿足現(xiàn)今牛場對BEF的檢測要求，本研究針對BEFV的G基因設(shè)計(jì)一對特異性引物，建立熒光定量PCR檢測方法，為臨床上BEF的診斷提供支持。

1 ?材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

樣本均采自云南省大理州兩個(gè)規(guī)?；?，為疑似BEFV感染的20份新鮮血液樣本，陽性對照為BEF疫苗。

1.1.2 主要儀器

移液器（KA0052521，DRAGON公司）、超凈工作臺（SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（75005440，Thermo Fisher Scientific公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-1600，天能科技有限公司）、電泳儀（DYY-7C，北京六一儀器廠）、熒光定量PCR儀（580BR 12007，BIO-RAD公司）、恒溫水浴鍋（HWS12，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3 主要試劑

RNAiso Plus購自寶生物工程（大連）有限公司（Cat. No.9109）;DEPC購自Sigma公司（Cat. No.V900882）;氯仿、異丙醇、無水乙醇等由筆者的實(shí)驗(yàn)室提供，均為分析純;熒光定量PCR相關(guān)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑iScriptTM cDNA Synthesis Kit購自BIO-RAD公司（Cat. No.170-8891）;熒光染料SsoFastTM EvaGreen? Supermix購自BIO-RAD公司（Cat. No.172-5201AP）。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank中公布的BEFV基因序列（MN781183.1、KY012742.1），設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增G基因片段的特異性引物（表1）用于PCR檢測。設(shè)計(jì)好的引物送昆明碩擎生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 BEFV RNA的提取

在2 mL離心管中加入300 μL處理好的疫苗及樣本，加入1 mL RNAiso Plus（TRIZOL），用力震蕩，使RNAiso Plus（TRIZOL）與樣本均勻混合，4 ℃靜置 10 min;10 min后加入200 μL的氯仿，用力震蕩，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min;小心吸取上層無色溶液約 ?500 μL于無RNAase的1.5 mL新離心管中，加入等量異丙醇，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部;小心倒去上清，向離心管內(nèi)加1 mL 75%乙醇清洗，7 500 r/min離心5 min;倒去上清，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁上的液體，每管加入20 μL DEPC水溶解RNA。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR

參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒（iScriptTM cDNA Synthesis Kit）的說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：SsoFastTM EvaGreen Supermix（2×） ? 10 μL，上游引物（10 μM）0.8 μL，下游引物（10 μM）0.8 μL，cDNA 1.5 μL，無RNase水6.9 μL，反應(yīng)總體系為20 ?L。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s，50 ℃～ 60 ℃梯度退火20 s;循環(huán)35次;收集溶解曲線65 ℃升高到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.2.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以BEF疫苗為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收純化后克隆于pMD18-T載體。對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切及測序鑒定。將構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒按10倍梯度稀釋（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），用不同稀釋度的樣本作為擴(kuò)增模板;以X軸為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的起始模板量，以Y軸為熒光定量PCR獲得的循環(huán)數(shù)，繪制BEFV的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 臨床樣本的檢測

用建立的熒光定量PCR檢測規(guī)?；鏊蜋z的臨床癥狀疑似牛流行熱感染的20份牛新鮮血液樣本，以了解該病在云南省牛場的感染情況。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 目的片段的擴(kuò)增鑒定

提取BEF疫苗中的疫苗毒株RNA，用所設(shè)計(jì)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)優(yōu)化過的反應(yīng)體系及引物的退火溫度，擴(kuò)增所得目的片段與預(yù)期擴(kuò)增片段大小308 bp相符，圖1是電泳結(jié)果。

2.2 構(gòu)建BEFV 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

BEFV溶解曲線峰值均單一，在陰性對照中，沒有發(fā)現(xiàn)特異性擴(kuò)增，可知引物特異性良好;分析顯示：R2>0.99，0.9≤E≤1.1，35個(gè)循環(huán)內(nèi)既沒有擴(kuò)增非特異性產(chǎn)物，也沒有產(chǎn)生引物二聚體，說明構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線成功。陽性質(zhì)粒擴(kuò)增后提取濃度為162 ng/μL，目的片段長度為308 bp，經(jīng)計(jì)算得到質(zhì)?？截惲繛?.91×10-10，證明所建立的熒光定量PCR方法可進(jìn)行絕對定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.3 臨床樣本檢測

利用建立的熒光定量PCR方法檢測了大理州2家規(guī)?；鏊蜋z的20份疑似牛流行熱感染的血液樣本，檢測顯示陽性樣本15份，證明建立的熒光定量PCR檢測方法可用于臨床試驗(yàn)以及BEFV流行病學(xué)調(diào)查等。部分樣本檢測結(jié)果如圖3所示。

3 ?討論

牛流行熱是牛（主要為奶牛）的一種急性、熱性、病毒性傳染病，在我國曾有幾次波及20個(gè)以上省、直轄市和自治區(qū)的大流行。該病危害奶牛的健康，導(dǎo)致產(chǎn)奶量減少，還會導(dǎo)致牛不能正常走動(dòng)，從而損失經(jīng)濟(jì)價(jià)值，牛群一旦感染會快速大范圍發(fā)病，造成巨大損失[8-9]。疾病的診斷要早和快，防治該病的前提條件是能否對該病建立快速、準(zhǔn)確的檢測。我國目前對該病的各種檢測方法研究不足，且操作麻煩，既耗費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)精力。因此，建立一種快速準(zhǔn)確且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的實(shí)驗(yàn)室診斷方法尤為迫切[10]。

本文通過反應(yīng)條件優(yōu)化、特異性檢測和靈敏度檢測，成功建立了BEFV 熒光定量PCR檢測方法。應(yīng)用建立的熒光定量PCR方法對云南部分地區(qū)送檢病料進(jìn)行檢測分析，20份樣本中陽性樣本有15份，陽性率達(dá)75%，說明當(dāng)前牛流行熱在牛場廣泛流行，我們應(yīng)對該病給予一定的關(guān)注。本次試驗(yàn)建立的牛流行熱檢測方法可以為該病的實(shí)驗(yàn)室檢測提供技術(shù)支持和參考。

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