王華松蘭生輝龐炯宇豐瑞兵楊晨曦袁功武曾文波

骨折在日常生活中十分常見，隨著人們經(jīng)濟(jì)水平的提升，越來越多的骨折患者愿意接受正規(guī)治療，以獲得更好的骨折愈合效果、更早的康復(fù)鍛煉。但美國骨科醫(yī)師學(xué)會指出，仍有5%～10%的骨折患者出現(xiàn)了骨折延遲愈合或骨不連[1-2]，這大大拖慢了患者回歸正常生活的腳步。近年來，隨著對信號通路領(lǐng)域的深入探索，研究者發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號通路與骨膜內(nèi)的干細(xì)胞（stem cells，SCs）關(guān)系密切[3]，而此類干細(xì)胞正是成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞的前身，是骨折愈合過程中的核心角色。故本次研究通過使用EGFR信號通路抑制劑Gefitinib干預(yù)股骨干骨折大鼠，旨在探索抑制EGFR信號通路對骨折愈合早期骨內(nèi)、外膜來源SCs的增殖、分化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

健康的SPF級SD大鼠50只（1月齡），雄性，體重104～115（109.7±3.2）g[湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，SCXK(鄂)20-150018]。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑與儀器

Gefitinib、甲基纖維素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、水合氯醛、PBS緩沖液、-巰基乙醇、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、L-抗壞血酸、L-脯氨酸、丙酮酸鈉、FITCBrdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒（武漢英顥科技有限公司）、-MEM完全培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、成骨誘導(dǎo)液（Gibco公司，美國），F(xiàn)ITC-CD29、FITC-CD34、FITC-CD45、FITCCD90（上海恒斐生物科技有限公司），von Kossa染液、阿爾新藍(lán)染液（武漢賽維爾生物科技有限公司），地塞米松、-甘油磷酸鈉、胰島素、維生素C（Sigma公司，美國），1×ITS、TGF-3（北京百奧萊博科技有限公司）。CO2恒溫培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀（Thermo公司，美國）、光學(xué)顯微鏡（上海光學(xué)儀器廠）、X光機(jī)（Siemens公司，德國）。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組

建立大鼠股骨閉合性骨折模型[4]:麻醉滿意后，常規(guī)右下肢備皮。取右下肢髕骨內(nèi)緣約1 cm縱行切口，逐步顯露髕骨并向外側(cè)脫位，于暴露的股骨髁間凹中心插入1枚20號注射針頭，沿髓腔至股骨大粗隆部穿出，再將針頭更換為直徑1.2 mm克氏針。取大粗隆處小切口顯露穿出的克氏針，將其折彎緊貼大粗隆骨皮質(zhì)，縫合切口。貼骨面剪斷股骨髁間凹處克氏針，縫合切口。再將大鼠右下肢固定于造模支架上，鈍骨刀輕壓于大腿中部，用500 g的重物于20 cm高處沿軌道自由落體撞擊，致股骨中段閉合性骨折。

選取鈍骨刀撞擊處無表皮裂傷的大鼠拍攝右股骨正側(cè)位X線片，其中短斜行或橫行股骨干骨折大鼠為造模成功大鼠，共42只。將造模成功的大鼠標(biāo)記后采用隨機(jī)數(shù)表法分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，各21只。

1.2.2 給藥

實(shí)驗(yàn)組大鼠給予Gefitinib 100 mg/（kg d）（溶于0.5%甲基纖維素）灌胃，對照組給予等量0.5%甲基纖維素灌胃。共持續(xù)1周。

1.2.3 骨內(nèi)、外膜來源SCs的分離、提取及培養(yǎng)

由于骨折1周后開始逐漸形成骨痂[5-6]，因此筆者于造模1周后處死大鼠并置于75%乙醇中消毒15 min。在無菌環(huán)境下提取右股骨，-MEM清洗后緩緩刮下骨外膜，用蛋白酶溶液（PBS+2 mg/mL膠原酶A+25 mg/mL胰蛋白酶）消化2 h，獲得骨外膜SCs的細(xì)胞懸液;用蛋白酶溶液消化股骨20 min，以徹底清除骨外膜SCs，隨后去除生長板兩端骨質(zhì)，將股骨沿縱軸切開，去除骨髓后用蛋白酶溶液消化2 h，獲得骨內(nèi)膜SCs的細(xì)胞懸液。將上述所得的細(xì)胞懸液低速離心10 min后棄去上清液，保留細(xì)胞沉淀，再分別接種后置于37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫孵箱中培養(yǎng)。24 h后換液并加入培養(yǎng)基（-MEM+20%FBS+55 M-巰基乙醇+2 mM谷氨酰胺+100 IU/mL青霉素+100 g/mL鏈霉素），再置于孵箱中培養(yǎng)。每2 d更換培養(yǎng)基，每3 d換液。當(dāng)細(xì)胞貼壁融合達(dá)90%時，再按1∶2傳代。

1.2.4 骨內(nèi)、外膜來源SCs表面標(biāo)志物鑒定

取第3代骨內(nèi)、外膜SCs，胰酶消化后計(jì)數(shù)。配制含0.5%BSA的PBS，各EP管中加入1 mL上述PBS及1×106個細(xì)胞;離心5 min后再用上述PBS清洗。然后每管100 L細(xì)胞懸液分別添加1 L抗體FITC-CD29、FITC-CD34、FITCCD45、FITC-CD90，4℃孵育30 min。再次離心后用上述PBS清洗并重懸，流式細(xì)胞儀檢測分析。

1.2.5 骨內(nèi)、外膜來源SCs增殖能力檢測

取第3代骨內(nèi)、外膜SCs，胰酶消化。再于6孔板中每孔加1 mL細(xì)胞懸液，密度為5×105/mL，37℃培養(yǎng)過夜。然后每孔加入BrdU調(diào)整濃度至30 M，孵育60 min。吸去培養(yǎng)基并收集細(xì)胞，重懸、離心、洗滌后每管加入500 L固定液，4℃固定過夜。洗滌、離心并每管加入500 L通透液重懸細(xì)胞，冰上孵育2 min，再次洗滌、離心。每管加入300 L含50 L變性劑的DNA變性工作液，再次洗滌、離心。用195 L染色緩沖液重懸細(xì)胞并每管加入FITCBrdU抗體5 L（0.125 g），4℃避光孵育30 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 骨內(nèi)、外膜來源SCs多向分化能力檢測

取第3代骨內(nèi)、外膜SCs，接種于成骨培養(yǎng)基（-MEM+10%FBS+10 mmol/L-甘油磷酸鈉+50 mg/L維生素C+0.1 mol/L地塞米松）及成軟骨培養(yǎng)基（-MEM+10%FBS+0.1 mol/L地塞米松+50 g/mL L-抗壞血酸+40 g/mL L-脯氨酸+100 g/mL丙酮酸鈉+1×ITS+10 ng/mL TGF-3）。成骨誘導(dǎo)21 d后行von Kossa染色，成軟骨誘導(dǎo)21 d后行阿爾新藍(lán)染色。在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨內(nèi)、外膜來源SCs表面標(biāo)志物鑒定

流式細(xì)胞儀測得FITC-CD29、FITC-CD34、FITC-CD45、FITC-CD90在實(shí)驗(yàn)組與對照組的骨內(nèi)、外膜SCs中表達(dá)相似，即CD29、CD90呈現(xiàn)高表達(dá)，CD34、CD45呈現(xiàn)低表達(dá)（見表1）。

表1 細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)率（%，n=21）

表1 細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)率（%，n=21）

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2.2 骨內(nèi)、外膜來源SCs增殖能力檢測

BrdU法檢測各組熒光信號倍增量發(fā)現(xiàn)，骨內(nèi)、外膜SCs的實(shí)驗(yàn)組熒光信號倍增量均顯著低于對照組（<0.01）（見表2）。Gefitinib抑制EGFR信號通路后，對骨內(nèi)膜SCs增殖抑制率為15.88%，對骨外膜SCs增殖抑制率為10.09%，可見骨內(nèi)膜SCs增殖活動被抑制更明顯。

表2 骨內(nèi)、外膜SCs熒光信號倍增量的比較（%，n=21）

表2 骨內(nèi)、外膜SCs熒光信號倍增量的比較（%，n=21）

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2.3 骨內(nèi)、外膜來源SCs多向分化能力檢測

骨內(nèi)、外膜SCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化、成軟骨誘導(dǎo)分化21 d后，進(jìn)行相應(yīng)染色可見:von Kossa染色者鏡下骨外膜SCs形成的礦化結(jié)節(jié)較骨內(nèi)膜SCs形成明顯;阿爾新藍(lán)染色者鏡下骨外膜SCs細(xì)胞內(nèi)的淡藍(lán)色顆粒較骨內(nèi)膜SCs細(xì)胞內(nèi)明顯（見圖1、圖2）。

圖1 成骨誘導(dǎo)后von Kossa染色結(jié)果（×200）:A.骨外膜SCs實(shí)驗(yàn)組;B.骨內(nèi)膜SCs實(shí)驗(yàn)組;C.骨外膜SCs對照組;D.骨內(nèi)膜SCs對照組

圖2 成軟骨誘導(dǎo)后阿爾新藍(lán)染色結(jié)果（×100）:A.骨外膜SCs實(shí)驗(yàn)組;B.骨內(nèi)膜SCs實(shí)驗(yàn)組;C.骨外膜SCs對照組;D.骨內(nèi)膜SCs對照組

3 討論

骨作為一個長期處于高度動態(tài)平衡的組織，一旦出現(xiàn)破損，能激發(fā)巨大的再生潛能，以重建其完整性及運(yùn)動功能[7]。骨折愈合主要通過兩種方式:一期愈合與二期愈合。一期愈合是指斷端復(fù)位并處于絕對穩(wěn)定的情況下，經(jīng)哈弗系統(tǒng)重建直接發(fā)生接觸式愈合，無明顯骨皮質(zhì)區(qū)吸收、無明顯外骨痂生成;二期愈合則在臨床上最為多見，包括膜內(nèi)化骨與軟骨內(nèi)化骨兩種形式，有骨痂生成[5,8]。膜內(nèi)化骨發(fā)生在愈合早期骨折近、遠(yuǎn)端表面，骨內(nèi)、外膜中的SCs分化為成骨細(xì)胞并合成、分泌新的骨基質(zhì)，骨基質(zhì)逐漸鈣化后形成內(nèi)、外骨痂，起到一個支架的作用，為斷端愈合提供亟需的穩(wěn)定環(huán)境[9-12]。軟骨內(nèi)化骨則發(fā)生在骨折端中央，SCs分化為軟骨細(xì)胞后合成分泌軟骨基質(zhì)，將斷端的纖維組織轉(zhuǎn)變?yōu)檐浌墙M織，隨后破軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞伴隨毛細(xì)血管侵入軟骨組織，使軟骨鈣化形成環(huán)狀骨痂和髓腔內(nèi)骨痂，連接骨折兩端恢復(fù)連續(xù)性，起到骨橋的作用[9,13]。由此可見，骨膜來源SCs在骨折愈合中的核心程度。

EGFR信號通路近些年來逐漸被學(xué)者們解密，發(fā)現(xiàn)其是機(jī)體調(diào)節(jié)骨代謝的重要途徑[14]。EGFR作為一種跨膜糖蛋白包括3個部分——胞外能與配體相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞內(nèi)的催化酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和酪氨酸殘基[15-16]。它在特異性配體刺激后形成一種二聚體，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化后激活下游接收者，從而達(dá)到調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)的目的，以影響細(xì)胞的增殖、分化、凋亡行為[13,17]。目前，已有許多研究證實(shí)了EGFR信號通路在骨折愈合過程中的關(guān)鍵作用。例如，Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-96可阻斷EGFR信號通路來促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化;Zhu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR激活后抑制成骨細(xì)胞核內(nèi)Runx2和Osterix基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制了成骨細(xì)胞的分化與礦化;Saito等[20]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR活化后能夠增加成骨細(xì)胞的數(shù)量;Chandra等[21]通過增加早期生長反應(yīng)2（early growth response，EGR2）的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和存活。但研究者們尚未深究EGFR信號通路—骨膜干細(xì)胞這一中間過程。同樣，本課題組通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)EGFR信號通路被抑制后能顯著加快大鼠股骨中段骨折的愈合進(jìn)程[3,22]，其中的具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

因此，本次實(shí)驗(yàn)使用Gefitinib抑制EGFR信號通路后檢測骨內(nèi)、外膜來源SCs增殖能力，成骨、成軟骨分化能力來探索在骨折愈合早期EGFR信號通路與此類SCs之間的關(guān)聯(lián)。首先，筆者對提取的骨內(nèi)、外膜SCs進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定，發(fā)現(xiàn)FITC-CD29、FITC-CD90呈高表達(dá)，F(xiàn)ITC-CD34、FITC-CD45呈低表達(dá)，這與Asumda等[23]的研究結(jié)果相吻合:成骨相關(guān)的干細(xì)胞高表達(dá)表面抗原CD29、CD90，低表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表面抗原CD45以及造血干細(xì)胞表面抗原CD34。其后，筆者通過BrdU摻入法檢測干細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)在骨折愈合早期骨外膜SCs的增殖力較骨內(nèi)膜SCs更強(qiáng)，同Gastel等[24]的結(jié)果類似，這可能與骨內(nèi)膜血供相對外膜偏少有關(guān)。在EGFR信號通路被抑制后，骨內(nèi)、外膜SCs的增殖力顯著被抑制，且骨內(nèi)膜SCs受抑制更明顯，這可能與影響了細(xì)胞周期抑制因子相關(guān)基因（P15、P16、P21、P27）的表達(dá)有關(guān)，需要后期深入探究。最后，筆者對SCs行成骨誘導(dǎo)分化21 d并染色后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組SCs的礦化結(jié)節(jié)較對照組更多;同樣，經(jīng)21 d成軟骨誘導(dǎo)分化并染色后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組SCs的淡藍(lán)色顆粒較對照組更多，表明通過Gefitinib抑制EGFR信號通路后，骨內(nèi)、外膜SCs的成骨、成軟骨分化能力增強(qiáng)。結(jié)合之前學(xué)者的研究，猜測抑制EGFR信號通路將抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、骨膜干細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞這一系列與骨折愈合密切相關(guān)細(xì)胞的增殖過程，但促進(jìn)它們的分化過程，這有待進(jìn)一步探索。

目前，骨折愈合的分子機(jī)制尚未被研究透徹，本研究將為學(xué)者們對其機(jī)制及EGFR信號通路的探索提供寶貴經(jīng)驗(yàn)，也將為EGFR信號通路成為促進(jìn)骨折愈合新的治療靶點(diǎn)提供更多理論基礎(chǔ)。