王冰 舒易來 陳兵

鼓膜 (tympanic membrane，TM)是一種半透明的菲薄結(jié)構(gòu)，由角質(zhì)化的鱗狀上皮外層、纖維狀中層和粘膜內(nèi)層三層結(jié)構(gòu)組成[1]。造成鼓膜穿孔的最常見病因有外傷、中耳炎和鼓膜置管術(shù)遺留的造口等。雖然大多數(shù)急性鼓膜穿孔是可以自愈的，但面積較大的穿孔或慢性穿孔需要外科手術(shù)干預(yù)才能修復(fù)。穿孔的鼓膜如果不能及時愈合，失去了阻擋外界細菌進入中耳的有效屏障，中耳感染的幾率將大大增加，嚴重者還會引起耳溢液、傳導(dǎo)性聽力下降甚至膽脂瘤的形成等，造成嚴重的并發(fā)癥。鼓膜穿孔的自愈通過上皮細胞的移行而完成，但常缺少纖維中間層，相較于正常鼓膜，自愈后的鼓膜更加脆弱、傳聲性能不理想、較易形成內(nèi)陷袋，并且在一定的氣壓傷時有再次穿孔的可能。因此，重建類似原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)是十分必要的。

目前，雖有多種鼓膜修補材料和術(shù)式可供選擇，但對于修補鼓膜的最佳材料仍未達成共識，鼓膜修復(fù)手術(shù)也存在一定的禁忌癥和并發(fā)癥[2]。常用的修復(fù)鼓膜穿孔的手術(shù)主要有鼓室成形術(shù)和鼓膜成形術(shù)，鼓膜成形術(shù)作為鼓室成形術(shù)的重要內(nèi)容之一，與其他手術(shù)，如：聽骨鏈成形術(shù)等，組合構(gòu)成多種類型的單純性鼓室成形術(shù)，也可與各種類型的乳突切除術(shù)構(gòu)成多種類型的乳突切除伴鼓室成形術(shù)。既往鼓膜修補使用的材料有消毒后的紙片、軟硅膠、脂肪或明膠海綿等，但這類材料修復(fù)鼓膜的有效性存在差異[3，4]。目前最常見的是利用耳后顳肌筋膜或軟骨膜自體移植，成功率較高，但也有再次穿孔的可能[5]。

鼓室成形術(shù)多需在全身麻醉下完成，手術(shù)成本較高，顯微手術(shù)的難度對耳外科醫(yī)生也是一種挑戰(zhàn)[6]，術(shù)后發(fā)生鼓膜再次穿孔可能需要再次手術(shù)修復(fù)，反復(fù)自體取材可能還會導(dǎo)致供區(qū)的組織病變，使自體移植材料的可用性變差[7]。為了解決以上問題，用于鼓膜修補的新型輔助材料和組織工程技術(shù)已應(yīng)用于實驗和臨床，以替代患者自體取材移植[4]。組織工程的基本方法包括支架結(jié)構(gòu)材料、生物因子和干細胞等；理想的支架材料可為細胞附著、生長和發(fā)揮正常功能提供良好的環(huán)境，生物信號分子和生長因子有助于增強細胞功能和促進整體組織的生長[8]。本文就鼓膜修補的組織工程學(xué)材料的研究進展進行綜述。

1 結(jié)構(gòu)材料

通常結(jié)構(gòu)材料包括脫細胞組織和聚合物[1]，目前已有多種具有優(yōu)良特性的結(jié)構(gòu)材料供鼓膜穿孔修復(fù)手術(shù)選擇，比如：細胞外基質(zhì)、交聯(lián)水凝膠、蠶絲纖維蛋白等等。

1.1細胞外基質(zhì) 細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)是天然來源的材料，由多細胞生物的細胞合成并分泌到細胞外，分布在細胞表面或細胞之間的大分子，可以為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供具有誘導(dǎo)性的支架材料[8]，這些支架的結(jié)構(gòu)和功能蛋白可作為鼓膜重建和組織特異性修復(fù)的模板。

膀胱細胞外基質(zhì)可以用作鼓膜修補的組織工程支架材料。Parekh等[9]將豬的膀胱經(jīng)去細胞化處理產(chǎn)生膀胱基質(zhì)，然后作為貼片材料用于誘導(dǎo)鼓膜穿孔的修復(fù)；膀胱基質(zhì)貼片治療組和對照組(自然愈合組)愈合后的鼓膜均較原生鼓膜厚，但前者鼓膜組織學(xué)分析顯示為更透明、均勻的結(jié)構(gòu)，而對照組自然愈合后的新生鼓膜有小囊泡和纖維結(jié)節(jié)等不均勻區(qū)域；由于樣本量較小，無法進行有意義的統(tǒng)計分析。此外，此研究缺乏對細胞提取后獲取的膀胱基質(zhì)這一修補材料的表征描述和相關(guān)特性的研究。

Deng等[10]在2009年利用豬真皮和硬腦膜進行脫細胞處理，獲得無細胞的ECM支架，然后從豚鼠鼓膜中分離鼓膜成纖維細胞進行接種，并且建立豚鼠鼓膜慢性穿孔的模型用于驗證這種材料的有效性；顯微鏡下觀察和組織學(xué)檢查顯示，隨著時間推移該支架能成功誘導(dǎo)成纖維細胞的生長并使鼓膜愈合，并且組織切片染色結(jié)果顯示愈合的鼓膜具有與正常鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試也顯示修復(fù)后的聽力有所提高[10]。隨著細胞提取技術(shù)的成功，脫細胞材料的生物相容性得到了充分的證明，異種生物材料可以用于鼓膜的組織工程學(xué)研究，利用此類移植物材料也可以減少手術(shù)時間和成本。另外，有國外文獻報道了對比脫細胞真皮與顳肌筋膜作為鼓膜移植物材料的療效[11]，對40例患者進行前瞻性隨機非盲試驗，實驗組采用厚度0.03 mm的脫細胞真皮、對照組采用顳筋膜修補鼓膜；結(jié)果顯示實驗組手術(shù)時間較對照組明顯縮短且術(shù)后疼痛也明顯減輕，同時兩組移植成功率及聽力結(jié)果無明顯差異。這項研究將脫細胞真皮與臨床上最常用的自體組織作比較，十分有意義，但這項研究并非雙盲試驗，并且使用脫細胞真皮之類的新型移植物材料也存在著成本問題。

1.2交聯(lián)水凝膠 目前為止，已有多種水凝膠和海綿材料應(yīng)用于組織工程學(xué)研究，此類材料來源于糖胺聚糖，具有促進傷口愈合和加速上皮化的能力，在修補組織缺損傷口的領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12]。Park等[13]在豚鼠急性鼓膜穿孔模型中比較了多種合成交聯(lián)水凝膠的療效，分別為Carbylan-SX、Gelatin-DTPH-PEGDA、Carbylan-S/GelatinDTPH、明膠海綿、外延膜、交聯(lián)硫代硫酸軟骨素，結(jié)果表明Carbylan-S/Gelatin-DTPH水凝膠、明膠海綿和硫代硫酸軟骨素修復(fù)的鼓膜穿孔愈合時間最短，其中硫酸軟骨素修補組出現(xiàn)了較強的炎癥反應(yīng)。Hakuba等[14]用水凝膠結(jié)合成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)對豚鼠急性鼓膜穿孔進行修補，結(jié)果bFGF處理組修復(fù)率較高，并且形成了與原生鼓膜相似的三層結(jié)構(gòu)，而對照組(生理鹽水組)僅有粘膜層和上皮層的再生。

1.3蠶絲 絲素是蠶絲中含有的一種具有彈性、可降解性和生物相容性的蛋白質(zhì)聚合物，這種特性使得蠶絲已被用于鼓膜組織工程學(xué)的支架材料研究[15, 16]。2010年，Ghassemifar等[15]在含血清培養(yǎng)基中，分別在蠶絲蛋白貼片(取自家蠶)和組織培養(yǎng)塑料薄膜(對照組)上培養(yǎng)人類鼓膜細胞15天，結(jié)果表明，與對照組相比，蠶絲蛋白貼片支持的鼓膜細胞生長計數(shù)水平要高于對照組，并且免疫熒光化學(xué)分析明確表明，蠶絲蛋白貼片組支持的細胞之間的接觸與粘附情況也優(yōu)于對照組；所以認為蠶絲蛋白是一種更適合于人類鼓膜細胞的支架材料，可以應(yīng)用于鼓膜組織工程學(xué)研究[15]。但是上述研究僅限于體外細胞的培養(yǎng)，而缺乏有效的體內(nèi)模型驗證。Kim等[16]對大鼠急性鼓膜穿孔模型進行修補處理，一側(cè)耳用蠶絲貼片修補，對側(cè)耳用紙貼片進行修補，結(jié)果示蠶絲貼片與紙貼片處理的鼓膜穿孔平均愈合時間分別為7.2天和9.1天，有統(tǒng)計學(xué)差異，組織學(xué)分析顯示，蠶絲貼片修補組有與天然鼓膜更相似的結(jié)構(gòu)[16]。此外，Levin等[17,18]對絲素對鼓膜再生的影響進行了研究，體外研究表明蠶絲貼片可以支持人類鼓膜角質(zhì)形成細胞的增殖和粘附?？偟膩碚f蠶絲可作為一種較為理想的天然材料用于鼓膜穿孔的修補。

2 影響鼓膜再生的生長因子

目前已有多種生長因子被廣泛用于鼓膜穿孔愈合的研究,其中被廣泛研究的生長因子有表皮生長因子[19～21]、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[22～25]、透明質(zhì)酸(HA)[26,27]，且大多數(shù)研究表明，這些生物因子對鼓膜的再生有顯著療效。

2.1透明質(zhì)酸 透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)是一種具有粘彈性的天然胞外多糖物質(zhì)[28]。MeroGel 是一種商業(yè)可用的酯化透明質(zhì)酸,Ozturk等[29]建立大鼠急性鼓膜穿孔模型來評估MeroGel和HA的有效性,結(jié)果顯示，MeroGel和HA處理組的鼓膜穿孔愈合率明顯高于對照組，并且這兩組效果無明顯差異；免疫組化分析結(jié)果示，MeroGel和HA處理組的成纖維細胞生長因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)含量明顯升高，所以MeroGel被認為是一種較為理想的鼓膜修補材料。

2.2表皮生長因子 Ramalho等[30]在亞急性鼓膜穿孔的栗鼠模型中研究表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)和己酮可可堿的作用，己酮可可堿是一種能夠增加局部微循環(huán)缺陷組織血流量和氧張力的藥物；實驗分為4組：對照組(n=9)：外用蒸餾水；A組(n=8)：局部外用EGF；B組(n=13)：口服己酮可可堿，每12小時10 mg/kg，連續(xù)10天；D組(n= 10)：外用EGF + 己酮可可堿。每組每隔72小時給藥一次，持續(xù)10天，所有動物均在鼓膜穿孔處放置可吸收的明膠海綿。結(jié)果鼓膜愈合率分別為：對照組8.7%，A組30.3%，B組3.6%，D組16.5%，提示EGF促進了鼓膜愈合，但是己酮可可堿沒有顯示出積極的結(jié)果，EGF和己酮可可堿之間也并無協(xié)同作用。此外，還有研究[31]對大鼠進行急性鼓膜穿孔造模后，分別用浸泡過透明質(zhì)酸和EGF的明膠海綿修復(fù)穿孔，結(jié)果顯示，與自然愈合的鼓膜穿孔相比，HA和EGF明顯縮短了鼓膜愈合的時間，但是HA和EGF兩組間差異不顯著；在組織病理學(xué)檢查中，治療組與對照組在鼓膜厚度、新生血管生成等方面亦無明顯差異?？梢姡砥どL因子能夠有效促進鼓膜穿孔的愈合。

2.3血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF) 血小板源性生長因子和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endogrowth factor, VEGF)形成了一個具有高度保守性的PDGF/VEGF同源結(jié)構(gòu)域，目前在鼓膜修補方面，關(guān)于PDGF和VEGF的研究還較為有限。Yeo等[32]研究了PDGF在鼓膜穿孔修補中的應(yīng)用，分別用PDGF(實驗組)和磷酸鹽緩沖液(對照組)處理大鼠急性鼓膜穿孔，結(jié)果示PDGF組穿孔鼓膜較對照組更快愈合，且組織學(xué)檢查顯示PDGF組處理后的新生鼓膜更接近原生鼓膜的三層結(jié)構(gòu)。Roosli等[33]首次在臨床試驗中研究PDGF對鼓膜再生的作用，對20例鼓膜穿孔患者隨機進行PDGF局部治療(用PDGF浸泡的消毒紙片處理穿孔鼓膜)和安慰劑治療，治療6周，結(jié)果顯示PDGF治療組與對照組相比沒有顯示任何優(yōu)勢。血小板源性生長因子對鼓膜穿孔愈合的研究目前較為有限，還有待更多的探索。

3 干細胞

用于鼓膜生物工程研究的細胞可以從原始組織、細胞系或干細胞中獲得，這些細胞可以在植入前注射或在體外植入[34]。目前，用于生物支架研究的細胞研究較為有限,除了上述已提及的Deng等[10]的研究外，von Unge等[35]在沙鼠急性鼓膜穿孔模型中，應(yīng)用小鼠胚胎干細胞處理鼓膜穿孔，結(jié)果顯示小鼠胚胎干細胞能夠改善鼓膜愈合。然而，當此法應(yīng)用于大鼠模型中時，未發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞對鼓膜穿孔愈合起到促進作用； 6個月后觀察修復(fù)后的鼓膜，處理組和未處理組新生鼓膜強度和剛度相似，但干細胞處理組鼓膜中層較厚[36]。隨后，此研究組又進一步將人間充質(zhì)干細胞應(yīng)用于豚鼠慢性鼓膜穿孔模型，結(jié)果顯示人間充質(zhì)干細胞處理后的鼓膜穿孔愈合率為40%，未處理組愈合率僅為10%；但免疫抑制劑(他克莫司)處理組呈現(xiàn)出愈合不良，并且中耳腔充滿了炎性肉芽和組織粘連[37]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，人類的鼓膜祖細胞在鼓膜臍部、鼓環(huán)以及錘骨柄部位，表明這些部位具有再生鼓膜干細胞的可能[38]。

干細胞在促進鼓膜再生方面顯示出了巨大潛能，經(jīng)過處理的干細胞結(jié)構(gòu)與原生鼓膜的結(jié)構(gòu)似乎十分相似，這對于鼓膜修復(fù)、重建聽功能和防止再次穿孔至關(guān)重要。然而，干細胞治療也存在倫理和成本方面的問題；因此，未來其他來源的細胞，如：自體角質(zhì)形成細胞也將成為重要研究方向。

4 展望

總的來說，各種原因?qū)е碌墓哪ご┛自谂R床上十分常見，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前對鼓膜穿孔修復(fù)的研究包括生物材料、生物因子、干細胞以及各種術(shù)式的選擇，存在各種挑戰(zhàn)，比如：生物材料的性能有待優(yōu)化，從而能適配鼓膜原有的生物力學(xué)和聲學(xué)特性；脫細胞基質(zhì)的選擇可能會涉及倫理問題，需要對患者充分告知；各種修復(fù)材料等尚需要進一步的研究和應(yīng)用。隨著各種新型材料的出現(xiàn)和改進，各種研究的不斷深入和臨床應(yīng)用終將對這一領(lǐng)域帶來光明的前景。