張海萍， 閆惠平

首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院 臨床檢驗中心， 自身免疫性肝病臨床研究中心， 北京 100069

自身免疫的血清學檢測是診斷和治療自身免疫疾病的關(guān)鍵指標。在國內(nèi)外自身免疫性肝炎(AIH)指南或共識中，自身抗體都是不可或缺的診斷指標之一[1-2]。利用自身抗體的靶抗原進行動物實驗或體外實驗研究是認識AIH發(fā)病機制的重要途徑。自身抗體不同于其他種類的檢驗項目，其特殊性在于：某些自身抗體的方法學對于結(jié)果的判斷和臨床意義的認識可以產(chǎn)生較大影響；出現(xiàn)于AIH的自身抗體種類較多，而且大部分患者檢測到的自身抗體對疾病都缺乏特異性；自身抗體也存在于病毒性肝炎和其他常見肝病中。因此在診斷AIH之前正確地理解和判斷自身抗體結(jié)果的臨床意義是很重要的。

參考自身抗體結(jié)果，AIH一般分為1型和2型兩種臨床型[3]。與AIH-1型相關(guān)的自身抗體主要包括：抗核抗體(ANA)、抗平滑肌抗體(anti-smooth muscle antibody，ASMA)、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(anti-soluble liver antigen and liver pancreas antigen, anti-SLA/LP, 以下簡稱抗-SLA)和抗中性粒細胞抗體(anti-neutrophil cytoplastic antibody, ANCA)；與AIH-2型相關(guān)的自身抗體主要包括：抗肝腎微粒體抗體(anti-liver kidney microsomal antibody，抗-LKM)和抗肝細胞溶質(zhì)抗原抗體-1(anti-liver cytosol type 1，抗-LC1)。本文將對自身抗體的基本檢測方法簡單評價，并簡介AIH的主要自身抗體。

1 相關(guān)指南對自身免疫性肝病主要自身抗體檢測方法的推薦意見

臨床醫(yī)生應了解自身抗體的檢測方法。自身抗體和免疫球蛋白是診斷自身免疫性肝病的關(guān)鍵指標，正確認識自身抗體的意義需要對用于自身抗體檢測的實驗室基本技術(shù)知識有所了解。

1.1 基本檢測方法 ANA總抗體的檢測方法依然推薦以HEp-2細胞(人喉癌上皮細胞系)作為基質(zhì)、間接免疫熒光法(indirect immune fluorescent assay, IIF)檢測[4-5]；肝臟相關(guān)的其他自身抗體，如ASMA，以嚙齒類動物組織為基質(zhì)、IIF法仍然是篩查的“金標準”。雖然IIF方法存在明顯不足，例如，該法采用的血清稀釋體系國內(nèi)各醫(yī)療機構(gòu)不統(tǒng)一，導致檢驗結(jié)果不能互認；其結(jié)果的判讀與技術(shù)人員水平、儀器等多因素有關(guān)。在許多檢驗項目中早已被其他方法學取代，但是在自身抗體檢測中，當前仍不可或缺[6]。目前，基于純化蛋白或重組抗原的檢測方法越來越多地被使用，主要優(yōu)點是不受觀察者的人為因素影響，但局限性是只能檢測到已被確定自身抗原靶點的自身抗體。已經(jīng)廣泛用于臨床的方法如，免疫印跡法(IB或WB)、ELISA及化學發(fā)光法、流式熒光法等，其中一些具有自動化程度較高、操作易于標準化等優(yōu)勢，可能成為這一領域的技術(shù)發(fā)展趨勢。

1.2 指南推薦的方法 歐洲肝病學會(EASL)AIH指南中強調(diào)：IIF法是除抗-SLA外所有AIH相關(guān)自身抗體常規(guī)檢測的首選和主要技術(shù)[2]。ANA、ASMA、抗-LKM-1和抗-LC1可以聯(lián)合檢測(如果抗-LKM-1陰性，還可以檢測LKM-3)。IIF法檢測肝臟自身抗體應在新鮮冰凍的嚙齒動物基質(zhì)上進行，通常包括腎臟、肝臟和胃。在原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)的指南[7]中推薦，對不能解釋原因的所有膽汁淤積病例，建議采用IIF法進行血清抗線粒體抗體(AMA)和PBC特異性ANA的篩查。而對AIH唯一具有診斷特異性的抗-SLA，由于缺乏典型熒光圖形而不推薦IIF法檢測。其確切的靶抗原已在分子水平上鑒定，并用于固相分析，因此推薦ELISA或免疫印跡方法(IB或WB)檢測抗-SLA。

2 AIH的主要自身抗體

2.1 抗核抗體(ANA)

是各種自身免疫疾病首選檢驗項目，最常見陽性但臨床意義最復雜多樣。

2.1.1 ANA在肝臟疾病中的檢出率 ANA是AIH最常見的自身抗體，是AIH-1型的診斷標志之一。在北美白人中，AIH的成年患者發(fā)病時80%可以檢測到ANA[3]，在歐洲50%～70%的AIH患者ANA陽性[2]，在我國70%～80%的AIH患者呈ANA陽性，ANA和(或)ASMA陽性者可達80%～90%[1]。但遺憾的是，這種最高檢出率的自身抗體對AIH的診斷并不是特異性的。依據(jù)AIH的診斷評分系統(tǒng)，ANA陽性的肝病患者需要先排除病毒性肝病等疾病，再結(jié)合血清IgG和肝組織學改變等特征才可以確診AIH[8-9]。 此外，疑似藥物性肝損傷的患者也可能出現(xiàn)ANA，或?qū)崬樗幬镎T導的AIH，需要謹慎做出鑒別診斷[6]。ANA在PBC患者中常以特征性的形式出現(xiàn)(抗gp210或抗sp100陽性，或熒光核型)，稱為PBC特異性ANA。ANA也可在原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)(29%)、慢性丙型肝炎(26%)、慢性乙型肝炎(32%)、非酒精性脂肪性肝病(34%)和慢性酒精性肝病(21%)中出現(xiàn)。在AIH以外的肝臟疾病中，ANA和ASMA同時出現(xiàn)的比例小于10%，如果同時出現(xiàn)兩種自身抗體，則AIH的診斷準確率從58%提高到74%[3]。

2.1.2 ANA的熒光核型 判讀IIF法ANA檢驗報告的臨床意義，主要依據(jù)其熒光核型和抗體滴度[10]。熒光核型是指采用HEp-2細胞為基質(zhì)，IIF檢測ANA時，由于ANA的靶抗原性質(zhì)或位置的不同，在熒光顯微鏡下觀察到的形態(tài)各異的熒光圖形。核型的分類可以依據(jù)“ANA核型的國際共識”[5]中的描述來報告：例如，位于細胞核的核型有核均質(zhì)型、核顆粒型、著絲點型、核仁型等；位于細胞漿的核型有胞漿顆粒型、高爾基體型、溶酶體型等。AIH患者的ANA可表現(xiàn)為核均質(zhì)型、核顆粒型、核仁型或混合核型，提示其靶抗原可能為染色質(zhì)、雙鏈DNA、核糖體蛋白等。但這些熒光核型均不是AIH診斷特異性的核型。例如，核均質(zhì)型在系統(tǒng)性紅斑狼瘡比較常見，是臨床需要鑒別的問題。相比之下，PBC的ANA具有特征性的核型，輔助診斷的作用要強很多：例如，核周型(或稱核膜型)及核點型ANA對PBC具有診斷特異性，被稱為PBC特異性ANA。由于人類肉眼分辨和判斷核型的能力有限，而目前基于計算機軟件的圖像分析系統(tǒng)判斷核型的能力也有諸多局限性，這是造成臨床ANA結(jié)果不一致的重要原因之一。

2.1.3 ANA滴度 ANA滴度對疾病診斷有重要價值，在自身免疫疾病時多表現(xiàn)高滴度陽性，而在病毒性肝炎、藥物性肝損傷等情況下可能低滴度陽性。如何判斷抗體滴度的高低？1∶160與1∶320孰高孰低？答案不能一概而論。目前國內(nèi)許多醫(yī)院與國外采用試劑不同，而國內(nèi)IIF檢測自身抗體主要有兩種稀釋體系，各個醫(yī)院采用試劑的檢測稀釋體系不同，可能會導致同一份樣本在A醫(yī)院報告1∶160陽性，而在B醫(yī)院報告1∶1000陽性。因此，不同醫(yī)院的ANA結(jié)果主要依據(jù)自己的參考范圍，不同稀釋體系之間的結(jié)果目前還難以互認。

2.2 抗平滑肌抗體(ASMA) ASMA與ANA均為AIH-1型的主要診斷標志，約半數(shù)ANA陽性的病例與ASMA有關(guān)。在歐洲AIH患者中50%～70%可檢測到ASMA，北美AIH患者中約63%出現(xiàn)ASMA，但國內(nèi)報道陽性率多低于歐美國家，僅有20%～30%的AIH患者呈ASMA陽性[1]。而且，ASMA還常常在病毒性肝炎患者血清中檢測到。后者的特點是抗體滴度一般較低，且有可能在一段時間內(nèi)陰轉(zhuǎn)。在美國，ASMA可作為PSC(6%)、慢性丙型肝炎(6%)和慢性酒精性肝病(4%)的單獨血清學指標出現(xiàn)[3]。

指南推薦采用IIF方法，以哺乳動物的胃、腎等組織作為基質(zhì)檢測ASMA[2]。ASMA在熒光顯微鏡下顯示不同的染色模式：血管/腎小球和血管/腎小球/腎小管模式被認為是對AIH診斷具有特異性的，而僅有血管模式的情況可在多種疾病中發(fā)現(xiàn)[11]。筆者牽頭在2018年依托兩個學會組織進行了“全國自身免疫性肝病相關(guān)自身抗體檢測室間質(zhì)量調(diào)查”活動，參與調(diào)查的138家醫(yī)療機構(gòu)(來自全國27個省、自治區(qū)和直轄市，以三級以上醫(yī)療機構(gòu)為主體)回報的結(jié)果提示，ASMA檢測全部采用IIF，與國際指南推薦方法一致。Shibuki等[12]報告，根據(jù)國際自身免疫性肝炎組織(International Autoimmune Hepatitis Group, IAIHG)提出的修訂評分系統(tǒng)，回顧分析了2009年-2014年在Saga肝病研究組的4家醫(yī)院診斷為AIH-1型的53例患者的病歷，所有患者治療后均獲得緩解，9例(17%)隨后復發(fā)。復發(fā)患者具有明顯年輕，ASMA陽性率高于未復發(fā)患者(100% vs 25%，P=0.001 2)的特點。而ANA滴度與復發(fā)率無關(guān)。提示ASMA是AIH-1型患者停藥期間或停藥后復發(fā)的一個預測指標；對高滴度ASMA患者應注意免疫抑制治療的隨訪。

2.3 抗肌動蛋白抗體(抗-actin) ASMA的靶抗原是細胞骨架成分，包括微絲、微管和中間絲，而微絲中主要是肌動蛋白，后者又可分為G-肌動蛋白和F-肌動蛋白。高滴度F-肌動蛋白抗體對診斷AIH-1的特異性較高。其與ASMA同時檢測或采用ELISA方法(定量)檢測，可有助于提高AIH的診斷率。曾有研究[13]顯示，ASMA(>1∶80)和抗-actin(>1∶40)與AIH-1型患者的血清生化指標和組織學疾病活動度有關(guān)，并預示治療失敗概率較高?？?actin陽性成人患者發(fā)病年齡早、糖皮質(zhì)激素治療反應較差，肝衰竭病死率和肝移植需求率均高于ANA陽性患者[13]。另外，抗-α-actinin是一種絲狀肌動蛋白交聯(lián)蛋白，存在于42%的AIH患者和66%的抗-actin 陽性AIH患者中[14]?？?actin和抗-α-actinin同時陽性與急性重型AIH、治療不完全及復發(fā)有關(guān)[14-15]。但近年有關(guān)抗-actin研究進展的報道較少。G-肌動蛋白則與酒精性肝硬化有關(guān)。

2.4 抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗體(抗-SLA) 1987年首次報道了抗-SLA[16]。2000年Wies等[17]應用高滴度SLA抗體血清對cDNA表達文庫進行免疫篩選，鑒定出抗-SLA與肝胰抗原(LP)系同一種靶抗原，故將其相應抗體統(tǒng)稱為抗-SLA/LP?？?SLA是一種可溶性胞質(zhì)蛋白酶，進一步的研究證明該抗原為O-磷酸絲氨酸-tRNA:硒-tRNA-合成酶，位于肝細胞漿內(nèi)，相對分子質(zhì)量為50 000。近年有文獻[6]已將抗-SLA/LP寫法簡化為抗-SLA。與其他自身抗體的檢測方法不同，指南推薦抗-SLA適宜采用ELISA、免疫印跡法或免疫斑點法等方法檢測[19]?；诿庖邔W新技術(shù)的檢測方法也已經(jīng)或者正在進入臨床。

在AIH患者中，抗-SLA呈現(xiàn)的突出特點是高特異性和低檢出率。它是目前國內(nèi)外公認唯一對AIH具有診斷特異性的自身抗體，國外報道[2,6,20]抗-SLA出現(xiàn)于AIH的頻率為10%～20%，我國一項多中心自身免疫性肝病回顧性調(diào)查[1]顯示，僅有6%(16/248)的AIH患者抗-SLA陽性。由于該抗體陽性檢出率很低，因此，大樣本的研究結(jié)果極少。筆者團隊[21]曾對此抗體作了一項較大樣本的回顧性分析，77例抗-SLA陽性病例源于歷時9年，自25 200例次肝病患者的血清中收集。這些抗-SLA陽性患者呈現(xiàn)幾個特征：(1)90.9%為女性；女性比例高于我國指南[1]中對AIH患者性別分布的描述(男女比例約為1∶4)。初次診斷AIH時平均年齡50歲以上；青少年中無該抗體陽性者。(2)初次診斷時80%以上患者抗體表現(xiàn)為強陽性。(3)抗-SLA與ANA同時陽性70例(90.9%)，無與抗-LKM或抗-LC1同時陽性者。(4)抗-SLA陽性的AIH及AIH/PBC 重疊綜合征患者40%(28/70)已進入肝病晚期或終末期，以失代償肝硬化及慢加急性肝衰竭為主。因此，鑒于抗-SLA對AIH診斷的高度特異性，對于不明原因肝病患者應送檢抗-SLA，以明確AIH的診斷。另一項大樣本結(jié)果源自2019年一項歐洲多國家多中心研究[22]，89例抗-SLA陽性和230例抗-SLA陰性的AIH患者在臨床表現(xiàn)及病理特征上是相似的；但是抗-SLA陽性的患者可能需要更長期的免疫抑制劑治療。

Chen等[23]對包括美國、德國、日本在內(nèi)的8個研究中心的1297例 AIH 患者進行Meta分析發(fā)現(xiàn)，與抗-SLA陰性患者相比，陽性患者的肝臟死亡風險增加3倍以上，治療復發(fā)風險增加近2倍。有報道[24]認為抗-Ro52常與抗-SLA同時存在，推測抗-SLA對疾病的不良結(jié)局可能與抗-Ro52同時存在相關(guān)。但迄今為止，SLA在AIH發(fā)病機制中的作用尚不清楚。

2.5 抗肝腎微粒體(抗-LKM)和抗肝細胞溶質(zhì)抗原抗體-1(抗-LC1)

2.5.1 抗-LKM 分為3個亞型，通常以IIF法檢測抗-LKM總抗體，用免疫印跡法、ELISA及其他免疫學方法檢測抗-LKM-1型抗體。抗-LKM(包括抗-LKM-1)和抗-LC1是AIH-2型的診斷標志，通常在ANA和ASMA陰性的情況下被檢測到。不同于以成年患者為主的AIH-1型，2型患者多見于青少年及兒童。AIH-2型患者很少見，僅占總AIH的3%～ 4%，且在不同地區(qū)不同人群中差異較大。北美成人中抗-LKM-1對AIH的敏感度較低(1%)，而在英國和加拿大，13%～38%的兒童AIH患者中可以檢測到抗-LKM-1[3]。

抗-LKM-1的靶抗原為細胞色素P4502D6，是較早被認識的AIH的靶抗原，并且有研究[25]證實在AIH患者肝臟內(nèi)有針對該自身抗原的CD4+和CD8+T淋巴細胞的存在。Gordon等[26]報道抗-LKM-1陽性的AIH患者比陰性患者的病情更嚴重。

2.5.2 抗-LC1 該抗體所識別的靶抗原是亞氨甲基轉(zhuǎn)移酶-環(huán)化脫氨酶，在10%的AIH-2型患者中抗-LC1是唯一可檢測到的自身抗體，其與AIH的疾病活動度和進展有關(guān)[3]。但該抗體臨床十分罕見，也鮮見報道。

抗-LKM-1和抗-LC1具有較高的AIH診斷特異性。但是，它們也存在于其他肝病中。筆者在多年臨床樣本中發(fā)現(xiàn)，抗-LKM和抗-LC1在丙型肝炎、乙型肝炎及藥物性肝損傷中也會出現(xiàn)。韓瑩等[27]報道北京佑安醫(yī)院十幾年積累的15例抗-LKM陽性病例，其中7例診斷為AIH，8例因HCV RNA陽性而診斷為丙型肝炎。筆者團隊曾診療1例反復肝功能異常伴有抗-LKM陽性兒童，初診時臨床和病理均診斷為藥物性肝損傷，經(jīng)糖皮質(zhì)激素反復治療后再次肝活檢，病理符合藥物誘導的AIH。由此提示，對抗-LKM陽性的兒童排除AIH診斷時需要謹慎。

2.6 AIH相關(guān)的其他自身抗體

2.6.1 抗中性粒細胞胞漿抗體(ANCA) ANCA尤其是非典型ANCA(pANCA)的存在，在缺乏其他自身抗體的情況下可提示AIH的診斷。由于它與PSC和炎癥性腸病也有關(guān)，這些疾病必須加以排除。

2.6.2 抗去唾液酸糖蛋白受體抗體(anti-asiaglycoprotein receptor, 抗-ASGPR) 抗-ASGPR是肝臟特異性的自身抗體，在AIH患者中有較高的陽性率。但遺憾的是，它對AIH并非特異性的，在病毒性肝炎等肝病中有一定陽性率，且一直缺乏可靠的商品化試劑，限制了其臨床應用。

3 AIH 新標志物的尋找

雖然AIH患者一般可以檢測到一種或幾種自身抗體，但是缺乏特異性血清標志物是AIH較之PBC診斷困難的主要原因。多年來，許多學者在新標志物的尋找方面做了大量工作，但臨床應用的成果并不顯著。有報道[28]指出，在1例接受肝移植術(shù)后7年出現(xiàn)新發(fā)AIH的9歲兒童血清中發(fā)現(xiàn)了一種新的肝臟微粒體自身抗體。該兒童出現(xiàn)移植功能障礙伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，血清γ球蛋白持續(xù)正常。肝組織學和大劑量潑尼松龍加硫唑嘌呤治療的反應支持新發(fā)AIH的診斷。IIF法檢測此自身抗體呈現(xiàn)一種新的染色模式(采用基于人類而不是大鼠肝臟蛋白的免疫印跡法)，顯示其為一種針對人的細胞色素P4502C19抗原的新的肝臟微粒體自身抗體。

德國學者Engel等在2019年EASL和IAIHG會議上報告了一種AIH診斷相關(guān)自身抗體：抗亨廷頓相互作用蛋白-1相關(guān)蛋白(anti-Huntington interacting protein-1 related protein，抗-HIR-1 RP)。在單中心研究呈現(xiàn)較好結(jié)果的基礎上，該作者已在歐洲多個國家開展了多中心研究，結(jié)果表明該自身抗體診斷AIH的特異性優(yōu)于ANA和ASMA，敏感性優(yōu)于抗-SLA和抗-LKM。如果抗-HIR-1 RP與ANA、ASMA三種抗體聯(lián)合檢測，可明顯提高AIH的診斷敏感性，特別是對于未治療的AIH患者，該自身抗體有更高的診斷價值。

4 總結(jié)與展望

盡管AIH的發(fā)病機制和診斷治療研究近年來取得了長足的進步，但依然面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。AIH的診斷較為復雜，是排除診斷基礎上的綜合診斷，缺乏特異性診斷標志物是AIH確診困難的主要問題。隨著免疫學、分子生物學等技術(shù)的迅速發(fā)展，期待有新的標志物被發(fā)現(xiàn)，對診斷或發(fā)病機制的認識更有幫助。在傳統(tǒng)的檢測方法基礎上，自身抗體的檢測技術(shù)也在不斷進展，期待其自動化、標準化的發(fā)展方向?qū)榕R床提供更準確、更便于解讀的方法，提高疾病的診斷和治療水平。