楊野梵 翟博雅 龔予希 張響 張智弘

南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，南京 210029

【提要】 胰腺癌病死率高，5年生存率僅有8%。PDAC占所有胰腺惡性腫瘤約90%，早期診斷困難，手術切除是其唯一可能的治愈方法，治療方式一直缺少突破性進展。二代測序(NGS)可以發(fā)現PDAC的突變基因，運用NGS的PDAC分子分型提出了PDAC的潛在治療靶點和發(fā)生機制。NGS還可以應用于生物標志物的檢測，有助于早期診斷和術后隨訪。對患者進行NGS檢測可以對藥物作用靶點進行篩選，提供個體化治療的可能。

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，5年生存率僅為8%[1]。 2018年的癌癥新發(fā)病例中，胰腺癌排名第14位，所導致的死亡排名為第7位[2]。PDAC約占所有胰腺惡性腫瘤的90%，導致其病死率高的原因包括早期診斷困難、缺乏特異性高的生物標志物、發(fā)現時通常已處于晚期而缺乏有效的治療手段等。家族中存在至少兩名患有PDAC的一級親屬者患胰腺癌風險幾乎是正常人的兩倍，多種遺傳性疾病也會增加患PDAC的風險[3]。近年來，通過廣泛應用二代測序(next-generation sequencing, NGS)中的全基因組測序和全外顯子組測序，發(fā)現了胰腺腫瘤中的許多基因突變和潛在的治療位點。

一、NGS在胰腺癌早期診斷和預后中的應用

對于有胰腺癌遺傳風險的人群，指南[4]推薦可以通過NGS檢測家族性胰腺癌易感基因BRCA2、PALB2、STK11、ATM、PRSS1等和家族性非典型多發(fā)黑色素瘤痣綜合征的p16種系突變、遺傳性結腸癌(Lynch綜合征)的MMR基因種系突變、Peutz-Jeghers綜合征的STK11基因種系突變，根據測序情況判斷是否需要進行胰腺腫瘤的篩查。

通過NGS可以發(fā)現能夠早期診斷和提示PDAC預后的基因。PDAC的4個散發(fā)性胰腺癌驅動基因(KRAS、CDKN2A的p16位點、TP53和SMAD4的DPC4位點)改變的頻率最高，這些基因可以作為靶基因進行早期診斷和殘留病灶檢測[5]。此外，Witkiewicz等[6]發(fā)現RBM10突變患者存活時間延長，ARID1A突變患者預后不良，攜帶MYC致癌基因的8q24基因座擴增與不良預后相關。非編碼RNA參與轉錄后調節(jié)或基因表達沉默，失調的非編碼RNA可以用作生物標志物進行早期檢測。研究者通過NGS發(fā)現了許多microRNA和lncRNA在PDAC組和對照組之間存在差異表達。其中miR-802在PDAC中顯著下調，miR-93在導管內乳頭狀黏液性腫瘤(intraductal papillary mocinous neoplasm, IPMN)中顯著上調[7-8]。

NGS可用于體液標本檢測，達到無創(chuàng)檢查的目的。Yu等[9]對115例包括健康者及PDAC、IPMN患者在內的受試者的胰液樣本進行數字NGS檢測，發(fā)現PDAC患者胰液中更容易檢測到TP53和(或)SMAD4突變，并且此類突變未在對照組中檢測到。突變體TP53和SMAD4濃度可區(qū)分PDAC與IPMN病例，靈敏度為32.4%，特異度為100%。值得注意的是，有兩例患者在胰腺癌診斷前1年內收集的胰液樣本中檢測到TP53或SMAD4突變，但影像學并未檢測到可疑的病變。同樣是基于胰液樣品的NGS分析，Kisiel等[10]從表觀遺傳學水平上檢測DNA甲基化。他們發(fā)現甲基化CD1D對檢測PDAC靈敏且特異，性能優(yōu)于突變型KRAS。胰液中的甲基化標志物水平不受年齡、性別、癌癥階段或部位的影響。另一項基于手術切除標本的DNA甲基化測序研究發(fā)現CpG位點的甲基化與患者存活率相關，FAM150A、ONECUT1、RASSF10等基因甲基化也與患者存活率增加有關，有作為生物標志物的潛能[11]。相較于組織活檢，對血液中循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)分離后進行NGS分析，可降低成本，且可以通過常規(guī)抽血，監(jiān)測腫瘤導致的基因突變的數量和性質。對于未獲得足夠NGS的腫瘤組織的患者，使用cfDNA的NGS可檢測到活檢樣本90.3%基因突變，診斷準確率為97.7%[12]。研究表明循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)是晚期PDAC的獨立預后指標，預示手術切除患者無病生存期較短[13]。

NGS作為早期診斷手段，被證明在某些方面優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。大約一半的胰腺囊腫是腫瘤性的，黏液性胰腺囊腫如IPMN和黏液性囊性腫瘤(mucinous cystic neoplasm, MCN)可以發(fā)展為浸潤性胰腺導管腺癌[14]，但影像學方法在診斷囊腫性質方面存在局限性。Singhi等[15]進行了一項前瞻性研究，分別用NGS和Sanger測序分析來自595例患者的626個胰腺囊腫液樣本，發(fā)現NGS檢測黏液性胰腺癌的KRAS和(或)GNAS突變具有89%的靈敏度和100%的特異度，高于Sanger測序65%的靈敏度和100%的特異度。NGS聯(lián)合檢測KRAS/GNAS和TP53/PIK3CA/PTEN，對胰腺癌進展的診斷靈敏度可達89%，特異度達100%。2019年的一項薈萃研究比較胰腺囊腫手術患者囊腫液的NGS基因檢測和微切片活檢的準確性，發(fā)現對于惡性和高風險的黏液囊腫，NGS基因檢測的診斷準確性高于微切片活檢[16]。

二、NGS在胰腺癌分子分型中的應用

研究表明，腫瘤的分子差異可以決定患者預后和治療效果。Collisson等[17]提出將PDAC分為3種分子亞型：經典型、類間充質型和外分泌型。Bailey等[18]使用RNAseq將PDAC按照分子病理和潛在機制分為4型：鱗型(squamous)、胰腺祖細胞型(panreatic progenitor)、免疫源型(immunogenic)和內外分泌異常分化型。鱗型富含TP53和KDM6A突變，預后較其他類型差。胰腺祖細胞型表達包括PDX1、MNX1、HNF4G、FOXA2等影響胰腺內皮細胞分化和導致青少年的成人起病型糖尿病的基因。免疫源型表現為免疫網絡水平總體上調。內外分泌異常分化型表現為影響腺泡細胞和內分泌細胞分化的基因表達上調。除免疫源型為新發(fā)現型別，其余3型與Collisson提出的上述3型重合，鱗型對應類間充質型，胰腺祖細胞型對應經典型，內外分泌異常分化型對應外分泌型。分子分型可參與預后判斷，一項對518例患者的NGS數據分析發(fā)現，胰體尾腫瘤患者的生存率明顯低于胰頭腫瘤患者，體尾部腫瘤與PDAC的鱗型亞型相關，鱗型亞型患者肝臟復發(fā)率高，分化差，腫瘤級別高[19]。Waddell等[20]對100 例PDAC患者進行全基因組測序和拷貝數變異分析，根據染色體結構變化和結構變異事件數量將PDAC分為4型：穩(wěn)定型、局部重排型、分散型和不穩(wěn)定型。結果表明局部重排型且包含治療靶點局灶擴增(如ERBB2、FGFR)腫瘤的患者，以及不穩(wěn)定型的具有DNA損傷應答缺陷的患者可能對鉑和聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase, PARP)抑制劑敏感。

三、NGS在胰腺癌治療中的應用

PDAC的NGS分子分型雖然尚處于起步階段，但近年來已經取得了實質性進展，為研究PDAC的治療提供了幫助。加拿大的COMPASS試驗通過全基因組測序和RNA測序，使用經典型與基底樣亞型的分子分型方案[21]，發(fā)現基底樣型對一線化療反應較差[22]。根據不同分子亞型突變基因的差異，篩選有藥物治療靶點的突變基因，對患者進行個性化治療。具有種系BRCA基因突變和轉移性胰腺癌的患者維持奧拉帕尼(PARP抑制劑)的無進展生存期延長[23]，鉑暴露的晚期BRCA相關的PDAC患者的總體生存率提高[24]。針對KRAS的關鍵下游信號(如RAF)的藥物對PDAC治療有效，使用YAP抑制劑和LY3009120(泛RAF抑制劑)對PDAC治療顯示出顯著增強的抗腫瘤效果[25]。Brauswetter等[26]提出將KRAS突變中的G12C突變單獨作為一型，因為KRAS G12C突變和低EGFR表達患者對單一MEK抑制劑(曲美替尼)治療敏感，而其余患者聯(lián)合治療更加有效。Waddle等[20]發(fā)現腫瘤抑制基因RNF43在10%的PDAC患者中失活，RNF43負反饋抑制Wnt/β-catenin通路信號轉導[27]，因此RNF43缺失患者可能會對Wnt抑制性藥物敏感。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability, MSI)是由DNA錯配修復序列基因缺失引起的，可在1%～2%的PDAC患者中檢出[28]。美國FDA批準派姆單抗(PD-1抑制劑) 用于存在MSI的任何實體腫瘤的一線治療。常規(guī)可通過免疫組化檢測錯配修復蛋白MLH1、MSH2、MSH6和(或)PMS2的丟失來鑒定MSI，但是免疫組化受組織固定、染色以及可用組織的限制較大。NGS允許同時對MSI位點進行全面研究，顯示突變負荷在PDAC中不均勻分布。因此Hu等[29]建議對轉移性或局部晚期PDAC患者，將NGS作為主要診斷檢測MSI，以評估是否使用免疫療法。

有研究者將NGS與基于證據的新型軟件工具(治療圖)結合，生成用于PDAC化療方案的個體化分析[30]。軟件基于對原始測序數據的分析檢測患者腫瘤的遺傳改變，自動搜索先前發(fā)表的遺傳改變的臨床意義，生成治療圖。將分析結果與患者實際化療結果進行比較。整個分析可在2周內完成，可用于臨床常規(guī)。這些結果表明基于NGS的軟件分析數據可以提供有效、無效和有毒藥物的循證信息，可能成為PDAC精準治療的基礎。

四、NGS在胰腺癌中對罕見基因的發(fā)現及對治療的探索

Biankin等[31]對142例PDAC患者進行全外顯子組測序后發(fā)現，除了已知在PDAC中發(fā)生突變的基因KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4、MLL3、TGFBR2、ARID1A和SF3B1，還新發(fā)現包括參與染色質修飾的基因EPC1和ARID2的突變，以及體細胞突變基因ATM。ATM基因首先由Roberts等[32]通過NGS在家族性胰腺癌中報道。Waddell等[20]對100 例PDAC患者進行全基因組測序后發(fā)現，最常見的PDAC突變基因分別是KRAS、TP53、SMAD4和CDKN2A，他們還發(fā)現另外兩個首次在PDAC中報道的基因KDM6A和PREX2。Witkiewicz等[6]對109例PDAC進行全外顯子組測序，首次發(fā)現包括BCLAF1、IRF6、FLG、AXIN1、GLI3和PIK3CA等基因的突變。

家族性胰腺癌(familial pancreatic cancer, FPC)是指患者至少兩名一級親屬患有胰腺癌，約占PDAC的10%[33]。有PDAC家族史的人與一般人群相比，患PDAC風險增加且發(fā)病年齡提前。了解導致FPC遺傳易感性的基因，可以早期檢測突變攜帶者，為個性化治療提供機會。在NGS被應用于PDAC基因檢測前，已發(fā)現BRCA1、BRCA2等基因在FPC的突變。FPC中最常見的突變基因是BRCA2，其蛋白質產物是PALB2蛋白的結合配體。Jones等[34]對96例FPC患者進行全外顯子組測序后在3例患者中發(fā)現了PALB2短縮突變，而1 084名健康者均沒有攜帶此突變，表明PALB2是FPC中第二常見的突變基因，這可能為PDAC的發(fā)病機制研究提供新思路。Roberts等[35]對638例FPC患者進行了全基因組測序，結果發(fā)現BUB1B、CPA1、FANCC、FANCG、ASXL1、DNMT3A和TET2的有害變異在FPC患者中更常見。這些候選基因有許多參與調節(jié)DNA修復或染色體穩(wěn)定性。

PDAC與糖尿病之間的雙向相互作用已經通過流行病學研究得到證實，對26例無糖尿病的PDAC患者和6例合并糖尿病PDAC患者的NGS分析發(fā)現13個突變基因(PIK3CD、SNCAIP、IRF4、HLA-A、NOTCH4、PIM1、ETV6、B2M、CD70、PRDM14、TGFBR1、FLT1和PARP2)僅出現在糖尿病組中，主要參與免疫相關通路，可能為探索糖尿病PDAC患者免疫治療提供新思路[36]。

五、小結

NGS現在廣泛運用于基因檢測、診斷和治療中，可檢測的標本多樣。應用NGS技術觀察到PDAC中許多種系和體細胞基因突變，通過對PDAC進行分子分型，發(fā)現了許多生物標志物和治療靶點。NGS可以提供海量的數據，但是仍受讀長的限制，質量有待提高，盡管長讀長測序可以克服NGS的這一大弱點，但成本相對較高并且通量較低[37]，NGS同時還和其他的技術之間存在競爭。隨著NGS技術的進一步發(fā)展，將更有助于PDAC的診斷和治療并最終改善患者的預后。

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