唐 旖，蔡 靈，楊 明

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門(mén) 361005；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444)

細(xì)胞培養(yǎng)作為研究細(xì)胞生物學(xué)乃至生物學(xué)的技術(shù)之一，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域占有重要地位。自Roux于1885 年從雞胚中分離細(xì)胞并首次建立體外細(xì)胞培養(yǎng)以來(lái)，單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已有百余年的歷史[1]，而且已經(jīng)在遺傳學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)取得了巨大的成果[2]。水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，其中最具有代表性的是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的體外培養(yǎng)技術(shù)。Wolf和Quimby建立了世界上第一個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系，即虹鱒魚(yú)生殖腺細(xì)胞系(RTG-2)。目前，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為魚(yú)類(lèi)生物學(xué)研究領(lǐng)域中一種重要的研究手段，除了被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞建系外，還被應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)胚胎干細(xì)胞、魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)、魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)、魚(yú)類(lèi)細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子、魚(yú)類(lèi)毒理學(xué)和腫瘤(癌)學(xué)、魚(yú)類(lèi)內(nèi)分泌學(xué)、魚(yú)類(lèi)細(xì)胞工程、遺傳育種與基因工程、抗病毒藥物與藥物檢測(cè)、魚(yú)類(lèi)資源保護(hù)等方面的研究[3]。

長(zhǎng)期以來(lái)，細(xì)胞的體外培養(yǎng)一直是在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶的二維平面上進(jìn)行的。然而越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，在二維的玻璃或聚苯乙烯底物上生長(zhǎng)的真核細(xì)胞與體內(nèi)三維結(jié)構(gòu)中的真實(shí)細(xì)胞狀態(tài)有很大不同，如細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞分化等方面[4-6]。為了更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)模式，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)并被越來(lái)越多的研究者所接受。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)最初的設(shè)想是設(shè)計(jì)一個(gè)生物相容性微孔支架，讓細(xì)胞在支架中生長(zhǎng)，模擬其在體內(nèi)的3D狀態(tài)[7]。但隨著研究的深入，不同的參數(shù)被考慮加進(jìn)培養(yǎng)系統(tǒng)，包括細(xì)胞的類(lèi)型、支架材料的選擇、特殊用途的需要等，這使得3D培養(yǎng)系統(tǒng)的復(fù)雜性越來(lái)越高。如今，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)在神經(jīng)細(xì)胞、癌癥和干細(xì)胞等許多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，3D培養(yǎng)系統(tǒng)也已發(fā)展得多種多樣，并仍在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。本文在介紹國(guó)內(nèi)外大量已有的相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的特點(diǎn)、發(fā)展歷程和應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)單的總結(jié)，并對(duì)3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用前景進(jìn)行了簡(jiǎn)介和展望。

1 3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展歷程

1.1 二維(2D)細(xì)胞培養(yǎng)的局限性

傳統(tǒng)的細(xì)胞研究大多采用2D培養(yǎng)的方式，細(xì)胞在二維平面上呈單層生長(zhǎng)。但這種培養(yǎng)方式與細(xì)胞在體內(nèi)所處的3D環(huán)境有很大區(qū)別，二維的平面使細(xì)胞失去了原來(lái)特定的形態(tài)功能特征和分化能力[4]。

2D與3D細(xì)胞培養(yǎng)相比，最明顯的區(qū)別在于沒(méi)有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的作用。ECM是多細(xì)胞有機(jī)體中，細(xì)胞周?chē)啥喾N大分子組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。它含有膠原蛋白、彈性蛋白和層粘連蛋白等蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)賦予組織機(jī)械特性，并幫助組織基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞之間的通訊[6]。ECM并非僅僅起惰性支持物的作用，或者將細(xì)胞連接在一起，形成組織器官，而是含有大量信號(hào)分子，積極參與控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、極性、形狀、遷移和代謝活動(dòng)[8]。

關(guān)于2D細(xì)胞培養(yǎng)的局限性，很早就有研究者進(jìn)行相關(guān)報(bào)道。Lanotte等[9]在進(jìn)行造血細(xì)胞的研究培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞可以附著在固體基質(zhì)上，并保持其功能活性，這意味著誘導(dǎo)環(huán)境中的一些細(xì)胞成分可能會(huì)丟失，而且細(xì)胞間相互作用的能力可能會(huì)降低。另外，也有很多研究表明，2D環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞與3D培養(yǎng)的細(xì)胞在組織結(jié)構(gòu)、形態(tài)功能方面有很大差異，3D細(xì)胞表現(xiàn)出更符合體內(nèi)真實(shí)的狀況。例如，在神經(jīng)細(xì)胞的研究中，神經(jīng)干細(xì)胞通常在培養(yǎng)皿中作為漂浮的聚集體或附著在培養(yǎng)皿表面的單層膜進(jìn)行擴(kuò)增。雖然用這些方法培養(yǎng)細(xì)胞被證明是一種有效的擴(kuò)大細(xì)胞的方法，但這些系統(tǒng)也限制細(xì)胞生長(zhǎng)到固定的幾何形狀，特別是在單層膜的情況下，細(xì)胞只在二維平面中擴(kuò)大。這種形態(tài)的改變可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的原有功能產(chǎn)生影響[10]。

1.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展

早在20世紀(jì)70—80年代就有研究者斷斷續(xù)續(xù)地開(kāi)始了細(xì)胞3D培養(yǎng)的探索。3D細(xì)胞培養(yǎng)的最初設(shè)想是設(shè)計(jì)一個(gè)生物相容性的微孔支架，細(xì)胞在支架中呈三維懸浮生長(zhǎng)。膠原蛋白是其中應(yīng)用較早的支架材料之一，它是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最為豐富的動(dòng)物蛋白，也是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成化合物，因?yàn)榫哂辛己玫纳锵嗳菪浴⒖缮锝到庑砸约吧锘钚?，所以其在食品、醫(yī)藥、組織工程等領(lǐng)域獲得廣泛的應(yīng)用[11-12]。Kleinman團(tuán)隊(duì)在20世紀(jì)70年代就對(duì)各類(lèi)膠原蛋白的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及其與細(xì)胞之間的作用關(guān)系進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，包括細(xì)胞粘附、蛋白與細(xì)胞的結(jié)合、膠原基質(zhì)的制備等[13-18]。最開(kāi)始被應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)的膠原蛋白是從小鼠體內(nèi)的提取的[19]。Lanotte等[9]用0.5 mol/L乙酸從大鼠尾腱中提取了I型膠原，并用以膠原與培養(yǎng)基按比例混合的簡(jiǎn)單方法來(lái)進(jìn)行造血細(xì)胞的3D培養(yǎng)。隨后，膠原蛋白被從各種不同的動(dòng)物組織中提取出來(lái)并用于細(xì)胞培養(yǎng)。

但是由于來(lái)源不同的細(xì)胞及其周?chē)沫h(huán)境的差異性，這種簡(jiǎn)單的方法不能很好地適用于所有細(xì)胞的3D培養(yǎng)，于是有研究者提出了改良方法。組織工程支架就是一種較為基礎(chǔ)的方式，它由生物材料或合成聚合物制成，能提供生物功能信號(hào)并與細(xì)胞良好地相互作用，同時(shí)能實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)的精確控制。Almany等[20]描述了一種由纖維蛋白原主鏈組成并與雙官能聚乙二醇(PEG)側(cè)鏈交聯(lián)的生物合成雜合支架。

從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，許多研究人員希望避免使用從活組織中提取材料，因?yàn)檫@些材料可能因批次的不同而出現(xiàn)差異，很難根據(jù)特定實(shí)驗(yàn)的需要進(jìn)行定制，因此大量的人工合成材料引起了人們的關(guān)注。Sun等[21]研究了三維電紡纖維支架的纖維直徑和纖維間距對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞行為的影響。他們將兩種不同模型材料聚苯乙烯和聚乳酸制成直徑范圍較寬的纖維，在專(zhuān)門(mén)研制的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中構(gòu)建。該方法確定了電紡支架設(shè)計(jì)的一些基本微結(jié)構(gòu)參數(shù)和成纖維細(xì)胞三維生長(zhǎng)的一些關(guān)鍵差異。另一種通常使用的支架材料是聚乙二醇(PEG)，因?yàn)樗菀妆还倌芑?。Loessner等[22]采用了高度靈活的全合成PEG基支架，由8臂PEG組成，通過(guò)微調(diào)不同組分，獲得具有不同硬度的水凝膠。

除凝膠和支架外，近些年還出現(xiàn)了一些新型的3D培養(yǎng)模型，如3D細(xì)胞微流控系統(tǒng)和磁力懸浮系統(tǒng)。3D細(xì)胞微流控系統(tǒng)通過(guò)將模擬細(xì)胞外基質(zhì)復(fù)雜生物化學(xué)和幾何形狀的表面與調(diào)節(jié)液體和可溶性因子運(yùn)輸?shù)奈⒘黧w通道相結(jié)合，為細(xì)胞生長(zhǎng)和刺激的時(shí)空控制創(chuàng)造了新的機(jī)會(huì)[23]。Ong等[24]提出了一種在不使用水凝膠的情況下在微流體系統(tǒng)中三維接種和培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的新方法。用一種瞬時(shí)細(xì)胞間聚合物接頭和微制造柱陣列的組合在微流體通道中形成和固定3D多細(xì)胞聚集體，這種方式減少了用于細(xì)胞支持的水凝膠的嵌入。

2 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用

水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)是從20世紀(jì)60年代開(kāi)始慢慢發(fā)展起來(lái)的，起初主要被用于病毒的分離和純化，目前這項(xiàng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)細(xì)胞、貝類(lèi)外套膜上皮細(xì)胞等的培養(yǎng)。細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)也是一項(xiàng)在細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)，目前在癌癥[25]、神經(jīng)干細(xì)胞[26]、心臟細(xì)胞再生[27]等方面發(fā)揮了重要作用。雖然因?yàn)榘l(fā)展時(shí)間較晚，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)方面還鮮有報(bào)道，但這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用應(yīng)引起重視。

2.1 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)上的應(yīng)用前景

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)始于20世紀(jì)60年代，之后各種魚(yú)類(lèi)的細(xì)胞系相繼建立，到目前為止，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系已經(jīng)超過(guò)280株。與哺乳動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)相比，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的培養(yǎng)比較容易，對(duì)傳代培養(yǎng)時(shí)間的要求彈性比較大，適溫范圍廣，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，已被廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖、魚(yú)類(lèi)生理和免疫學(xué)以及資源保護(hù)等方面[28]，尤其在對(duì)魚(yú)類(lèi)病毒的預(yù)防和治療上發(fā)揮了很大作用[29]。

魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)與其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一樣，總體上可分為原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞在經(jīng)過(guò)幾次傳代后，會(huì)逐漸失去原細(xì)胞的生理生化功能特性，而原代培養(yǎng)的細(xì)胞仍能保留部分同在體內(nèi)細(xì)胞一樣的生理功能特性[30]，因此，原代細(xì)胞更適合用來(lái)進(jìn)行相關(guān)的魚(yú)類(lèi)學(xué)實(shí)驗(yàn)。但即使是原代培養(yǎng)的細(xì)胞，也受到很多限制，在實(shí)踐中，短期培養(yǎng)的魚(yú)類(lèi)細(xì)胞功能基因可以正常表達(dá)，但是長(zhǎng)期體外培養(yǎng)條件下的細(xì)胞會(huì)丟失許多功能。這可能是由于體外培養(yǎng)的細(xì)胞缺少在體內(nèi)條件下的ECM環(huán)境和有效的細(xì)胞間相互作用所造成的，而3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能給魚(yú)類(lèi)細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)類(lèi)似于魚(yú)體內(nèi)的懸浮環(huán)境，使細(xì)胞長(zhǎng)期保持原有的生理功能和特性。用膠原凝膠作為支架進(jìn)行魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的3D培養(yǎng)或許是一個(gè)可行的方法。Falguni等[31]從淡水魚(yú)中提取了膠原蛋白并首次研究了這種膠原蛋白的生物相容性和免疫原性，他們用這種膠原蛋白支架進(jìn)行了3D細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示魚(yú)膠原蛋白支架表現(xiàn)出和牛膠原蛋白相當(dāng)?shù)募?xì)胞活力，表明源自淡水的魚(yú)膠原支架在性質(zhì)上具有高度生物相容性。Choi等[32]用靜電紡絲法制造了一種由魚(yú)膠原蛋白(FC)和聚己內(nèi)酯(PCL)混合物組成的新型納米纖維支架，這種新型支架以魚(yú)膠原蛋白的含量來(lái)控制納米纖維的直徑大小，以支架結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞粘附、擴(kuò)散、突起和增殖，為魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的3D培養(yǎng)提供了潛在的平臺(tái)。

2.2 3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在貝類(lèi)上的應(yīng)用前景

對(duì)貝類(lèi)的組織和細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)始于20世紀(jì)70年代，已報(bào)道的關(guān)于貝類(lèi)的組織培養(yǎng)主要集中在文蛤、牡蠣等常見(jiàn)貝類(lèi)[33-35]。外套膜是珍珠貝孕育珍珠的場(chǎng)所，是珍珠貝插核形成珍珠的必要條件，目前插核所用的外套膜大多采自于珍珠貝活體膜。關(guān)于貝類(lèi)外套膜組織的離體培養(yǎng)已有很多嘗試，相關(guān)研究證明，離體條件下培養(yǎng)的珍珠貝外套膜組織和自然狀態(tài)下的一樣，都能分泌豐富的珍珠質(zhì)[36]。用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)珍珠貝的外套膜組織進(jìn)行離體培養(yǎng)，將有利于減少珍珠貝的使用量，從而增加經(jīng)濟(jì)效益。

貝類(lèi)養(yǎng)殖是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的一個(gè)重要部分，貝類(lèi)細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)還可以被用于貝類(lèi)病毒的研究。體外培養(yǎng)的細(xì)胞是進(jìn)行病理和免疫機(jī)理研究的良好素材，不僅可以被用于鑒定病毒，還可以被用于研究病毒的感染、復(fù)制、形態(tài)發(fā)生和遺傳變異等。此外，通過(guò)培養(yǎng)貝類(lèi)的免疫細(xì)胞，可進(jìn)行貝類(lèi)免疫機(jī)制的研究和篩選增強(qiáng)免疫機(jī)能的活性物質(zhì)或藥物[37]。因此，細(xì)胞的3D培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用對(duì)貝類(lèi)的疾病防治可能具有重要意義。

3 展望

在各種研究數(shù)據(jù)的支持下，3D細(xì)胞培養(yǎng)模型優(yōu)于2D傳統(tǒng)培養(yǎng)已經(jīng)成為共識(shí)。與2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)中的細(xì)胞更接近于與細(xì)胞形狀和環(huán)境有關(guān)的體內(nèi)情況，已被用于研究多種組織和細(xì)胞，包括前列腺、乳腺、肌肉、結(jié)腸、食道、成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞等。3D培養(yǎng)技術(shù)雖然具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但在應(yīng)用方面仍不夠成熟。對(duì)不同來(lái)源的細(xì)胞需要形成不同的模擬環(huán)境，這需要相對(duì)復(fù)雜的條件和技術(shù)。但可以預(yù)見(jiàn)的是，隨著材料科學(xué)和生物工程技術(shù)的發(fā)展，3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)將會(huì)越來(lái)越成熟。水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)胞培養(yǎng)在近些年發(fā)展快速，但同時(shí)也面臨著一些問(wèn)題，而3D培養(yǎng)系統(tǒng)為細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種新思路，將會(huì)有力地推動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。