姜海燕，陳云雨，張西臣

·論著·

乳酸桿菌和沙門氏菌對BALB/c鼠感染旋毛蟲的影響

姜海燕，陳云雨，張西臣

714100 安徽，渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院中藥教研室（姜海燕）；241002 安徽，皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評價研究所（陳云雨）；130062 長春，吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院（張西臣）

分析保加利亞乳酸桿菌、沙門氏菌及培養(yǎng)上清對旋毛蟲感染的 BALB/c 鼠體內(nèi)成蟲與肌幼蟲荷蟲量的影響，旨在為旋毛蟲病的防治提供新思路，如以腸道菌為資源制成的疫苗或其他藥物制劑。

通過 Real-time PCR技術(shù)對小鼠腸道菌群定量分析，確認(rèn)保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌定植；感染旋毛蟲 5 d 后，分析小鼠體內(nèi)成蟲荷蟲量變化；感染旋毛蟲 35 d 后，分析小鼠體內(nèi)肌幼蟲荷蟲量變化。

保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌均能促進(jìn)小鼠排蟲，分別引起成蟲減少 45.3% 和 22.3%，培養(yǎng)上清效果稍差，分別減少了 29.0% 和 14.8%；兩者分別引起肌幼蟲減少 54.0% 和 38.3%，培養(yǎng)上清分別引起肌幼蟲減少 43.7% 和 37.7%。

保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌均能夠保護(hù) BALB/c 鼠減少旋毛蟲的感染。

保加利亞乳酸桿菌； 沙門氏菌； 旋毛蟲

旋毛形線蟲（）簡稱為旋毛蟲，由其感染引起的旋毛蟲病，是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病[1]。目前，此病治療仍以使用甲苯咪唑等藥物驅(qū)殺為主，化學(xué)藥物長期和不規(guī)范應(yīng)用導(dǎo)致寄生蟲對傳統(tǒng)藥物已產(chǎn)生抗藥性，免疫預(yù)防將成為該類疾病防控的最佳途徑。

旋毛蟲生活史中肌幼蟲發(fā)育到成蟲及孵育新生幼蟲階段都在胃腸道中，期間與腸道菌緊密接觸。彼此之間必然相互影響。近年來，腸道菌及腸道菌和寄生蟲的相互關(guān)系已成為科學(xué)界研究的熱點(diǎn)。曼徹斯特大學(xué)的科研人員將幾種不同的腸道菌與鼠鞭蟲體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌能夠通過鞭毛與鼠鞭蟲直接接觸，促進(jìn)鼠鞭蟲的孵育[2]；反過來，寄生蟲也能影響腸道菌群的構(gòu)成，如旋毛蟲感染小鼠后，引起小腸中乳酸桿菌比例增加和結(jié)腸中梭桿菌比例的提高[3]。但是，細(xì)菌如何影響旋毛蟲感染需要進(jìn)一步研究。

通過分析乳酸桿菌和沙門氏菌對旋毛蟲感染的 BALB/c 鼠體內(nèi)成蟲及肌幼蟲荷蟲量變化的影響，為更深入了解腸道菌與寄生蟲及宿主之間關(guān)系提供理論基礎(chǔ)，并為尋找新型抗寄生蟲藥物提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 微生物菌株 保加利亞乳酸桿菌（，）ATCC 11842由吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院贈予；腸沙門氏菌（，）ATCC 9115 由軍事科學(xué)院十一所贈予。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物和蟲株 BALB/c 健康小鼠，雌性，3 周齡，清潔級，購于長春市生物制品所實(shí)驗(yàn)動物中心；SD 大鼠保種的旋毛蟲由吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑 DNA Ladder、DNA 凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品；熒光定量 PCR 引物由上海生物工程有限公司合成；其他試劑購自鼎國昌盛生物公司。

1.2 方法

72 只雌性健康 BALB/c小鼠隨機(jī)分為乳酸桿菌組、乳酸桿菌培養(yǎng)上清組、沙門氏菌組、沙門氏菌培養(yǎng)上清組、對照組、空白對照組，共 6 組，每組 12 只。每日給小鼠飲用添加 5 mg/L 環(huán)丙沙星的高壓滅菌水，持續(xù)一周。然后，乳酸桿菌組和沙門氏菌組小鼠分別每日灌胃乳酸桿菌和沙門氏菌各 1 × 109CFU；乳酸桿菌培養(yǎng)上清組和沙門氏菌培養(yǎng)上清組小鼠分別每日灌胃乳酸桿菌和沙門氏菌的培養(yǎng)上清各 0.1 ml（培養(yǎng) 24 h，5000 ×離心 10 min）；對照組和空白對照組小鼠每日灌胃生理鹽水各0.1 ml。連續(xù)灌胃 7 d，停止灌胃 24 h 后，收集各組小鼠糞便，通過 Real-time PCR 技術(shù)對小鼠糞便進(jìn)行菌群定量分析，確認(rèn)保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌定植后，除空白對照組外，各組小鼠經(jīng)口感染旋毛蟲肌幼蟲 300 條/只，5 d 后，將每組中 6 只小鼠斷頸處死，取出小腸，縱向剖開，37 ℃生理鹽水中孵育 4 h，顯微鏡下計數(shù)小鼠腸道成蟲數(shù)量[4]。感染 35 d 后，將每組剩余 6 只小鼠剖殺，不同部位肌肉經(jīng) 1% 胃蛋白酶和 1% 鹽酸消化，分析每克肌肉中旋毛蟲肌幼蟲數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用 SPSS6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌定植

每日給小鼠灌胃 1 × 109CFU 的細(xì)菌，連續(xù)一周，利用實(shí)時熒光定量 PCR 技術(shù)對腸道菌群進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，乳酸桿菌組及沙門氏菌組中，乳酸菌屬和沙門氏菌屬的數(shù)量明顯增加（≤ 0.01），表明保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌分別在腸道內(nèi)成功定植。

2.2 BALB/c 小鼠腸道內(nèi)成蟲荷蟲量變化

感染旋毛蟲 5 d 后，保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌均不同程度引起小鼠體內(nèi)旋毛蟲荷蟲量變化。其中，乳酸桿菌及其培養(yǎng)上清分別引起成蟲荷蟲量減少 45.3% 和 29.0%，沙門氏菌及其培養(yǎng)上清分別引起成蟲荷蟲量減少 22.3% 和 14.8%（表 1）。

2.3 BALB/c 小鼠體內(nèi)肌幼蟲荷蟲量變化

感染旋毛蟲 35 d 后，與對照組相比，乳酸桿菌及沙門氏菌分別引起小鼠肌幼蟲減少 54.0% 和 38.3%，培養(yǎng)上清效果稍差，但也分別引起肌幼蟲減少 43.7% 和 37.7%（表 2）。

3 討論

為了研究保加利亞乳酸桿菌和沙門氏菌定植小鼠腸道后對旋毛蟲感染小鼠的影響，首先要確保兩者能夠在機(jī)體內(nèi)定植。傳統(tǒng)的細(xì)菌計數(shù)方法具有耗時長和計數(shù)結(jié)果誤差相對較大等缺點(diǎn)，實(shí)時熒光定量PCR 技術(shù)更適合對糞便樣品中細(xì)菌定量檢測。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源性保加利亞乳酸桿菌能夠幫助小鼠降低旋毛蟲感染，培養(yǎng)上清也有類似作用，可能與該菌分泌的某種未知分子有關(guān)，或者乳酸桿菌誘導(dǎo)了 Th1 型細(xì)胞因子 IL-12 和 IFN-γ 的表達(dá)[5]，從而激活巨噬細(xì)胞使機(jī)體迅速獲得針對旋毛蟲抗原的特異性免疫因素。益生菌在抗腸道寄生蟲感染中的作用已得到證實(shí)[6]，盡管之前的研究結(jié)果顯示，體外乳酸桿菌對旋毛蟲活力有促進(jìn)作用[7]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宿主受寄生蟲感染情況下，乳酸桿菌對宿主更有利。乳酸桿菌的益生作用、宿主免疫應(yīng)答和與旋毛蟲清除三者之間可能存在某種復(fù)雜聯(lián)系，其具體抗蟲作用分子機(jī)制仍需深入探索。

表1 乳酸桿菌和沙門氏菌對小鼠體內(nèi)旋毛蟲成蟲荷蟲量影響（感染5 d）

Table 1 Effect ofandoral treatment on the number of adult worms in mice, five days after thechallenge

組別GroupsBALB/c 鼠數(shù)量（只）Number of mice成蟲荷蟲量（）Adult worm recovery ()成蟲減少率（%）Reduction comparedwith control (%)P 值P value 對照組 Control6148.5 ± 10.5 乳酸桿菌組 L. bulgaricus681.7 ± 10.145.3< 0.01 乳酸桿菌上清組 Supernatant L. bulgaricus culture6105.5 ± 9.629.0< 0.05 沙門氏菌組 S. enterica6115.2 ± 14.022.3< 0.05 沙門氏菌上清組 Supernatant S. enterica culture6126.5 ± 11.114.8< 0.05

表2 乳酸桿菌和沙門氏菌對小鼠體內(nèi)旋毛蟲肌幼蟲荷蟲量影響（感染35 d）

Table 2 Effect ofandoral treatment on the number of larvae per gram of muscle tissue in mice, 35 days after thechallenge

組別GroupsBALB/c 鼠數(shù)量（只）Number of mice肌幼蟲荷蟲量（）Larvae per gram muscletissue ()肌幼蟲減少率（%）Reduction comparedwith control (%)P 值P value 對照組 Control61698.0 ± 84.2 乳酸桿菌組 L. bulgaricus6781.5 ± 91.454.0< 0.01 乳酸桿菌上清組 Supernatant L. bulgaricus culture6956.5 ± 81.643.7< 0.01 沙門氏菌組 S. enterica61048.3 ± 92.438.3< 0.01 沙門氏菌上清組 Supernatant S. enterica culture61058.2 ± 67.837.7< 0.01

沙門氏菌作為一種人獸共患病原菌，在體外單獨(dú)與旋毛蟲培養(yǎng)，可抑制旋毛蟲的存活與繁殖[7]。在體內(nèi)定植后，減少了旋毛蟲成蟲與肌幼蟲荷蟲量，類似效果在重組減毒株沙門氏菌可保護(hù)小鼠不受寄生蟲感染的研究中也被發(fā)現(xiàn)[8]。但降低旋毛蟲感染作用沒能達(dá)到體外共培養(yǎng)結(jié)果預(yù)期的效果，可能感染旋毛蟲引起腸道菌群中益生菌的恢復(fù)導(dǎo)致。

我國仍然是世界上旋毛蟲病危害最為嚴(yán)重的少數(shù)幾個國家之一，科研人員一直尋找新的防治策略和方法，乳酸桿菌和沙門氏菌能夠降低旋毛蟲對宿主的感染，在影響寄生蟲侵入宿主及建立其長期寄生生活有潛在的應(yīng)用價值，作用機(jī)制可能與分泌某種特殊蛋白分子有關(guān)，研究結(jié)果有助于進(jìn)一步了解宿主-多病原體相互作用的機(jī)制，并為以乳酸菌或減毒腸道沙門氏菌為載體的寄生蟲疫苗及其他制劑的研制提供理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上的應(yīng)用需要更深入的研究。

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Effect ofandoninfected BALB/c mice

JIANG Hai-yan, CHEN Yun-yu, ZHANG Xi-chen

The aim of the present study is to evaluate the effects of(),() and their supernatants from culture on the percentage of adult worm and larvae in mice infected by(), thus providing a new way for the prevention and treatment of trichinosis.

Quantitative analysis of the intestinal flora was performed using the real-time quantitative PCR technique. The percentage of adult worm and larvae reduction in the intestine at different days afterinfection were compared with the control group.

The percentage of adult worm was reduced by 45.3% and 22.3% in mice treated withand,respectively, compared with control group, while the percentage of adult worm was reduced by 29.0% and 14.8% respectively after treatment with supernatants from culture, at day 5 afterinfection. The percentage of larvae per gram of muscle tissue was reduced by 54.0% and 38.3% after treatment withand, respectively, as compared with controls, while the percentage of larvae was reduced by 43.7% and 37.7% in mice treated with respective supernatants, at day 35 afterinfection.

,and the supernantants from culture could protect againstinfection.

;;

ZHANG Xi-chen, Email: xczhang@jlu.edu.cn

渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研課題（WZYZ201708）

張西臣，Email：xczhang@jlu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.007

Author Affiliations:Weinan Vocational & Technical College, Shannxi 714100, China (JIANG Hai-yan); Institute for Drug Screening and Evalution, Wannan Medical College, Anhui 241002, China (CHEN Yun-yu); College of Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062, China (ZHANG Xi-chen)

2020-05-11