劉長遠 ，劉 麗 ，賈 姝 ，趙 達

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學院，遼寧沈陽 110161；2.沈陽大學，遼寧沈陽 110044）

葡萄霜霉病[Plasmopara viticola（Berk et Curtis）Bert.et Toni]是葡萄生產(chǎn)上第一大病害，在全世界葡萄主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。該病主要為害葉片和果實。一般年份產(chǎn)量損失20%～30%[1-2]。葡萄霜霉病菌是專性寄生菌，因不能在人工培養(yǎng)基上繁殖和保存，使該病害及其病原菌的深入研究增加了難度；生產(chǎn)上缺乏客觀科學反映葡萄抗霜霉病鑒定和評價技術。針對以上問題開展了葡萄霜霉病菌保存與抗霜霉病鑒定技術研究[3-4]，根據(jù)研究結果整理提出了葡萄霜霉病菌保存及快繁方法和葡萄抗霜霉病鑒定技術，打破了葡萄霜霉病菌無法長期保存的技術瓶頸，科學評價品種抗病性，為該病害持續(xù)深入研究和有效防治奠定了基礎。

1 葡萄霜霉病菌活體葉片保存法

葡萄霜霉病菌活體葉片保存法是經(jīng)葡萄霜霉病菌分離純化、葡萄活體葉片接種、容器適溫短期保存和葉片冷凍長期保存等步驟。

1.1 病菌分離純化

采集新鮮葡萄霜霉病病葉，用無菌毛刷蘸取無菌水刷去病葉表面的雜物和白霜狀霉層，將該葉片放到墊有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，封口膜密封保濕，在22～25℃條件下全光照培養(yǎng)24 h，用無菌毛刷將葉片長出的新鮮孢子囊菌體刷至無菌水中，配制獲得1×105個/mL的病菌新孢子囊懸浮液。

1.2 葡萄活體葉片接種

選取葡萄感病品種新鮮離體健康葡萄活體葉片，用無菌毛刷蘸取無菌水刷去葉表面的雜物，葉柄用浸水后的脫脂棉包裹，葉背面朝上置于直徑為15cm墊有無菌水浸濕過濾紙的塑料培養(yǎng)皿中，待葉背面水分晾干后立即噴霧接種剛配成的病菌孢子囊懸浮液，封口膜密封保濕，在22～25℃條件下全光照培養(yǎng)5～7 d獲得新鮮菌體葉片。

1.3 容器適溫短期保存

將接種好病菌葉片的容器放到培養(yǎng)箱冷藏短期保存，在3℃溫度下可保存20～30 d。葉片冷凍長期保存，即將接種好病菌的葉片置于自封袋中，然后立即將其放到超低溫（-80℃）冰箱中保存，此方法可保存病菌2年以上。

2 葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液保存法

葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液保存法是經(jīng)病菌保護劑配制、病菌孢子囊懸浮液制備、超低溫保存等步驟。

2.1 病菌保護劑配制

將二甲基亞砜和脫脂牛奶按照1∶1比例配制而成。

2.2 保護劑和病菌復配

將病菌保護劑混合液和新配制的病菌孢子囊懸浮液（1×105個/mL）按照1∶9比例復配，最終配制成5%二甲基亞砜+5%脫脂牛奶+90%病菌孢子囊懸浮液的混合液。

2.3 超低溫保存

將配置好的混合液立即裝入凍存管內(nèi)，裝液量占總容量的3/4，然后將裝有混合液的凍存管迅速放入超低溫（-80℃）冰箱內(nèi)保存，此方法可保存病菌3年以上。

3 葡萄霜霉病菌快速繁殖法

葡萄霜霉病菌快速繁殖法是經(jīng)葡萄健康葉片選擇、容器規(guī)格、病菌選取和接種擴繁等步驟。

3.1 葡萄健康葉片選擇

選取葡萄新梢頂端3～5葉位或葉齡為25～35 d的健康葉片，用無菌水清洗干凈葉片，葉柄用浸水后的脫脂棉包裹，葉背朝上置于墊有無菌水浸濕過濾紙的培養(yǎng)皿中。

3.2 容器規(guī)格

選取直徑為15 cm塑料培養(yǎng)皿裝取葉片。

3.3 病菌選取

采用新鮮葉片接種獲得的葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液；或由超低溫（-80℃）冰箱冷凍長期保存的葡萄霜霉病菌，先經(jīng)4℃活化3 h，將活化菌種接種新鮮葉片，獲得葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液。

3.4 接種擴繁

將配制濃度為1×105個/mL的病菌孢子囊懸浮液，噴霧接種容器內(nèi)的葉片，用封口膜密封保濕，放置在培養(yǎng)室或培養(yǎng)箱全光照培養(yǎng)，病菌侵染階段采取22℃培養(yǎng)24 h，以后轉入病菌擴展階段，溫度控制在25℃左右，病菌培養(yǎng)7 d后可看到葉片長滿白霜狀霉層的病菌，實現(xiàn)葡萄霜霉病菌快速大量繁殖。

4 葡萄抗霜霉病鑒定技術

該技術適用于各種葡萄資源對霜霉病抗性的室內(nèi)外鑒定及評價。

4.1 霜霉病菌接種體制備

葡萄病原菌分離、保存和繁殖采用葡萄霜霉病菌活體葉片保存法、葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液保存法和葡萄霜霉病菌快速繁殖法。

4.2 室內(nèi)抗性鑒定

4.2.1 鑒定室設置。人工接種鑒定室應具備人工調節(jié)溫度、濕度及光照的條件，使人工接種后具備良好的發(fā)病環(huán)境。

4.2.2 鑒定對照材料。選擇葡萄抗病和感病品種各1種作為鑒定時的抗病和感病對照品種。

4.2.3 鑒定材料育苗。將待鑒定的葡萄苗定植于花盆內(nèi)，隨機或順序排列，每份材料重復3次，每重復10株苗?；|為草炭、蛭石和菜田土（2∶1∶1），經(jīng)高溫蒸汽滅菌（134℃，30 min）。在育苗栽培生長室內(nèi)溫度為23～25℃。鑒定時所有幼苗應生長健壯、葉齡一致。

4.3 接種

4.3.1 接種時期和接種濃度。葡萄萌芽展葉后15 d。接種葡萄霜霉病菌孢子囊懸浮液濃度為1×105個/mL。

4.3.2 接種方法與接種后管理。采集每個葡萄品種枝條頂端倒數(shù)第2～4位置的健康葉片，無菌水沖洗后，用消毒的打孔器打下直徑為1.5 cm圓盤，每個處理重復4次，每重復50葉碟，葉背朝上放入培養(yǎng)皿中，下鋪一層滅菌吸濕濾紙，噴布孢子囊懸浮液，密封保濕，22℃下全光照培養(yǎng)。

4.4 病情調查

4.4.1 調查時間。室內(nèi)接種7～10 d，調查發(fā)病情況。

4.4.2 病情級別劃分。葡萄霜霉病病情級別標準[5-8]：0級：全葉無病斑；1級：病斑面積占整個葉面積5%及以下；3級：病斑面積占整個葉面積6%～25%；5級：病斑面積占整個葉面積26%～50%；7級：病斑面積占整個葉面積51%～75%；9級：病斑面積占整個葉面積76%以上。

4.4.3 調查方法。根據(jù)病害分級標準調查每份鑒定材料接種發(fā)病情況，記載病情級別，計算出病情指數(shù)（DI）。

病情指數(shù)（DI）計算按下列公式計算：

病情指數(shù)=[∑（各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值）／（調查總葉數(shù)×9）]×100

4.5 抗病性評價

4.5.1 抗病性評價標準。依據(jù)鑒定材料4次重復的病情指數(shù)（DI）平均值確定其對霜霉病的抗性水平，品種反應型劃分標準按照國際植物種質委員會（IB-PGR）的標準，將其分為 5種類型，即免疫（I）：病情指數(shù)為 0；高抗（HR）：病情指數(shù)為 0.1～5.0；抗病（R）：病情指數(shù)為 5.1～25.0；感?。⊿）：病情指數(shù)為25.1～50.0；高感（HS）：病情指數(shù)為 50.1～100.0。

4.5.2 鑒定有效性判別。當感病對照材料達到相應感病程度（DI＞50）時，抗病對照材料與實際抗性程度相符，該批次抗霜霉病鑒定視為有效。

4.6 鑒定材料處理

鑒定完畢后將發(fā)病葡萄葉片集中焚燒或深埋處理。

4.7 鑒定記載

葡萄抗霜霉病鑒定結果需記載品種/種質名稱及來源、定植日期、接種日期、接種病原菌分離物編號各小區(qū)病情級別，計算出病情指數(shù)，明確不同葡萄品種室內(nèi)抗性試驗的品種反應型。

4.8 田間抗病性評價

調查不同葡萄品種田間自然條件下發(fā)病情況，對葡萄品種進行室外田間抗病評價，比較室內(nèi)外品種抗病性，對不同葡萄品種做出科學評價。

5 小結

葡萄霜霉病菌屬于專性寄生菌，該類病原菌往往都不能在培養(yǎng)基人工培養(yǎng)。該文提出的葡萄霜霉病菌活體葉片保存法、孢子囊懸浮液保存法和快速繁殖法可實現(xiàn)該病菌長短期保存和大量病菌繁殖，這為該病菌短期和長期持續(xù)研究提供了技術支撐。葡萄有多種抗病機制，其中結構抗病性是重要機制之一，葡萄有些品種具有濃密的葉背絨毛等結構，在田間自然條件下由于霜霉病菌不易接觸葉背表面，這些品種常常表現(xiàn)為良好的抗病性；但在室內(nèi)抗病性評價時，由于供試葡萄葉片背面向上被放置在培養(yǎng)皿，接種的病菌易于接觸葉片表面，并且濕度較大，導致室內(nèi)外抗病反應類型有時不一致，因此為了準確評價品種抗病類型應采取室內(nèi)外結合的評價方法對其進行綜合判別。利用葡萄抗霜霉病鑒定技術可對葡萄品種和品質資源進行抗病性評價，對選育和推廣抗病品種，有效防治葡萄霜霉病具有重要意義。